Eine funktionelle Charakterisierung der frühendosomalen SNARE-Proteine

Ein Großteil des intrazellulären Transports erfolgt über das Abschnüren, den Transport und die anschließende Fusion von Vesikeln, wobei dieser letzte Schritt von SNARE-Proteinen bewerkstelligt wird. Neben deren Funktion in der Fusion wird schon seit einiger Zeit auch über eine Beteiligung an dem, der Fusion vorausgehenden Prozess des Docking, d.h. der stabilen Verknüpfung der Organellen spekuliert. Diese Frage wurde in der vorliegenden Arbeit an frühen Endosomen untersucht. Frühe Endosomen bilden ein zentrales Sortierungskompartiment, in dem die meisten Endozytoserouten zusammenlaufen und können untereinander fusionieren, was sie zu einem viel genutzten Modellsystem gemacht hat. Um den Einfluss der SNARE-Proteine auf das Docking von frühen Endosomen analysieren zu können, musste zunächst ein geeignetes Assay entwickelt werden, da sich das für das vakuoläre System bekannte Aggregationsassay als nicht geeignet herausstellte. Mit dem neuen Assay konnte gezeigt werden, dass zwar EEA1 und Rab5 wie erwartet wichtig für das Docking von frühen Endosomen sind, dass dieses aber von einer SNARE-Funktion unabhängig ist, da weder das Verhindern der SNARE-Aktivierung durch mutiertes alphaSNAP, noch die Zugabe von löslichen SNARE-Fragmenten oder gegen die SNAREs gerichteter Fab-Fragmente einen großen Einfluss auf das Docking hatte, während die Fusion signifikant inhibiert wurde. Versuche, die SNARE-Regulation über die Rekonstitution der endosomalen SNAREs in Liposomen und anschließende Fusion mit frühen Endosomen zu analysieren, haben sich als sehr schwierig herausgestellt. Das Problem lag hierbei nicht etwa darin, dass keine Fusion erzielt worden wäre, sondern im Gegenteil daran, dass selbst proteinfreie Liposomen mit Endosomen fusionierten und zwar in vergleichbarem Umfang und praktisch identischer Kinetik wie SNARE-haltige Liposomen. Durch die Vergrößerung der Liposomen (und den dadurch reduzierte Krümmungsstress) stieg die Spezifität der Reaktion etwas an, so dass Proteoliposomen doppelt so stark mit Endosomen fusionierten wie proteinfreie Liposomen. Der vielversprechendste Weg scheint jedoch ein top-down Ansatz zu sein, d.h. Endosomen zu solubilisieren, einzelne Proteine über Immundepletion aus dieser Mischung zu entfernen und aus den verbleibenden Proteinen und Lipiden ueber Detergenzentfernug Proteoliposomen mit sehr endosomenähnlicher Zusammensetzung zu erzeugen. Für das Docking und die Fusion von Endosomen ist das Zusammenwirken von zahlreichen Faktoren erforderlich, welche in der Regel in spezialisierten Membrandomänen konzentriert vorliegen. Die Regulation dieser Domänen ist jedoch noch weitgehend unklar und wurde daher im letzten Teil der vorliegenden Arbeit für SNAREs und Synaptophysin untersucht. Bisher war es aufgrund der geringen Größe von Endosomen (ungefähr 200 nm Durchmesser) sehr schwer, Aussagen über unterschiedliche endosomale Domänen zu treffen, da sie im Bereich der Auflösungsgrenze konventioneller Lichtmikroskopie liegen. Für die vorliegende Studie konnte jedoch auf die neuentwickelte STED-Mikroskopie zurückgegriffen werden, wobei das verwendete kommerziell erhältliche Gerät eine Auflösung von 70-90 nm besitzt und die endosomale Membran dadurch einer Analyse zugänglich machte. Das im zweiten Abschnitt gewonnene Wissen über die Fusion von Liposomen mit Endosomen konnte hier genutzt werden, um über diese Fusion die Lip! idzusammensetzung der Endosomen zu verändern. Allerdings führten weder erhöhte Cholesterinkonzentrationen noch die Zufuhr von PI und PIP2 zu einer Veränderung in der Zahl der Cluster, was auf eine relative Stabilität dieser hindeutet. Interessanterweise scheinen auch die als Membranorganisatoren ins Spiel gebrachten Rab-Proteine keineswegs essentiell für diese Domänen zu sein, da die Extraktion der Rab-Proteine durch GDI praktisch keinen Einfluss auf die Domänenanzahl der untersuchten Proteine hatte.

Author dc:creator

• Geumann, Ulf

Contributors dc:contributor

• Jahn, Reinhard Prof. Dr.
• Ficner, Ralf Prof. Dr.

• 570 Biowissenschaften, Biologie
• Biologie
• Endosomen
• Docking
• Domänen
• Liposomen
• SNARE
• endosomes
• domains
• liposomes
• 42.15
• WH 000: Cytologie {Biologie}

Licence

• https://webdoc.sub.gwdg.de/diss/copyr_diss.html

Language dc:language

ger

Identifier

https://dx.doi.org/10.53846/goediss-342
urn:nbn:de:gbv:7-webdoc-2142-3
webdoc-2142
617782105

OAI identifier oai:identifier

oai:ediss.uni-goettingen.de:11858/00-1735-0000-0006-AD5F-7