Differentielle Genexpressionsanalyse aktivierter Endothelzellen

Differential Display-PCR (DD) ist eine komparative mRNA-Fingerprinttechnik zur Identifikation differentiell exprimierter Gene durch die vergleichende Darstellung randomisiert amplifizierter cDNA-Teilpopulationen. Ein optimiert elaboriertes Protokoll dieses Verfahrens wurde eingesetzt zur genetischen Expressionsanalyse aktivierter Endothelzellen als in vitro-Modell für die Biologie der Angiogenese, der Sprossung von Blutgefässen aus bereits bestehenden. Dabei kam ein zweidimensionales in vitro-Modell boviner Aortenendothelzellen (BAEC) zum Einsatz, bei dem zwei aktivierte, subkonfluent proliferierende Zellpopulationen ohne und mit Zytokinstimulation (bFGF, Fibroblasten-Wachstumsfaktor II) gegenüber zwei konfluent arretierten Populationen ohne und mit Inhibitor (funktionsneutralisierender Antikörper) desgleichen Zytokins verglichen wurden.Von den bearbeiteten 107 reproduzierten regulierten Banden aus 90 DD-Primerkombinationen liessen sich 86 Genfragmente zwischen 300-1200 bp reamplifizieren und klonieren. Davon konnte für 47 Fragmente (55%) die Regulation im Northern-blot verifiziert werden, eine methodenspezifisch überdurchschnittliche Positivrate. Die bearbeiteten 41 hochregulierten Fragmente liessen sich im Sequenzdatenbankabgleich auf 35 distinkte Gene zurückführen, 16 neue und 19 bekannte Gene, darunter das Proteasom, Endothelin 1, Thrombospondin 1, Caveolin 1, Lipocortin 1, alpha-Gi sowie verschiedene Hitzeschockproteine. Für sämtliche neuen Gene wurden die Expressionsmuster in 8 verschiedenen Organgeweben und dem physiologischen Angiogenesemodell des weiblichen ovariellen Zyklus im Northern-blot bestimmt. Fünf ausgewählte neue Gene konnten mittels EST-Datenbank (expressed sequencetags) durch überlappende Integration vollständig identifiziert und kloniert werden und in der EMBL-Datenbank deponiert. Deren eingehendere Charakterisierung erbrachte einen membranständigen (40-9-1) und 4 lösliche Proteinkandidaten, darunter zwei mit metabolischem Bezug (40-9-1, 42-9-9), ein Zellzyklusregulator (40-6-3) sowie einer mit partieller Homologie zu einem Transkriptions-coaktivator (40-2-3). Von besonderem Interesse im angiogenen Kontext sind davon das 10-transmembranöse Transporterprotein-homolog (40-9-1) und die regulativen Elemente (40-2-3, 40-6-3), sowie der verbleibende Kandidat (67-11-3) ohne näher bestimmte Funktion, für deren weitere Analyse strategische Ansätze erstellt wurden.Die Arbeit adressiert die generellen Vor- und Nachteile von DD und diskutiert sie ausführlich im Spiegel aktueller Ansätze des Expressions-profilings. Dabei werden die beiden gegenwärtigen Limitationen von Expressionsanalysen herausgearbeitet, nämlich die überwiegend noch ausstehende Bearbeitung der meisten identifizierten Kandidaten sowie die Unvollständigkeit und Ungenauigkeit gegenwärtiger Datenbanken mündend in die Auswahl bearbeiteter Kandidaten nach pragmatischen anstelle biologischer Kriterien. Demgegenüber steht das beachtliche Potential der neuen genomweiten Expressionsanalysen in der angehenden genomischen Ära nach der vollständigen Sequenzierung des humanen Genoms.

Author dc:creator

• Schmidt, Tobias

Contributors dc:contributor

• Augustin, Hellmut G. PD Dr.
• Hardeland, Rüdiger Prof. Dr.
• Söling, Hans-Dieter Prof. Dr.
• Gradmann, Dietrich Prof. Dr.

• 570 Biowissenschaften, Biologie
• Biologie
• Differential Display
• Endothelzellen
• EC
• HUVEC
• BAEC
• Angiogenese
• Genregulation
• Expressionsanalyse
• Northern-blot
• Expressionsklonierung
• endothelial cell
• angiogenesis
• gene regulation
• expression analysis
• expression cloning
• 42.13
• 42.15
• WD

Licence

• https://webdoc.sub.gwdg.de/diss/copyrdiss.htm

Language dc:language

ger

Identifier

https://dx.doi.org/10.53846/goediss-76
urn:nbn:de:gbv:7-webdoc-1076-1
webdoc-1076
33397302X

OAI identifier oai:identifier

oai:ediss.uni-goettingen.de:11858/00-1735-0000-0006-ABD6-9