Molekulare, biochemische und strukturelle Untersuchungen an amylolytischen Enzymen von Thermotoga maritima MSB8

Das hyperthermophile Bakterium Thermotoga maritima MSB8 (Wachstumsbereich: 55°C - 90°C) ist eines der thermophilsten und ursprünglichsten aller bisher bekannten Mikroorganismen und verwertet durch einen fermentativen Stoffwechsel organische Polymere wie z.B. Stärke. An diesem Prozeß sind thermostabile Enzyme wie Glucosidasen und Maltodextrin Glycosyltransferasen beteiligt. AglA ist das erste Beispiel einer Maltodextrin umsetzenden alpha-Glucosidase mit einer ungewöhnlichen Abhängigkeit der enzymatischen Aktivität von einem Pyridinnukleotid-Kofaktor, Mn2+ und reduzierenden Bedingungen. Durch Gelfiltrationsstudien konnte gezeigt werden, daß das native AglA als Homodimer aus zwei identischen 55 kDa Untereinheiten vorliegt. Dabei spielt die An- oder Abwesenheit der genannten aktivierenden Komponenten für die Dimerisierung keine Rolle. Zur Klärung der Funktion konservierter Aminosäurereste wurden ortsspezifische Mutagenesestudien durchgeführt. Die extrem thermostabile nicht-hydrolytische Transferase MTase ist ebenfalls ein Homodimer. Die Transferaktivität des Enzyms ist streng auf die Übertragung von Maltosyleinheiten beschränkt. In Kooperation mit einer anderen Arbeitsgruppe gelang die Kristallstrukturaufklärung der MTase (MTase-Maltose-Komplex) mit einer Auflösung von 2,4 Å (2,1 Å). Die katalytische Kerndomäne enthält die typische ''TIM-barrel''-Struktur der Glycosylhydrolase Familie 13 mit dem aktiven Zentrum (katalytische Reste: Asp385, Glu414 und Asp468) am C-terminalen Ende des ''barrels''. Die Struktur ergab zwei Maltose-Bindestellen: eine befindet sich im aktiven Zentrum und definiert die ''subsites'' -2 und -1, die zweite liegt in einer Tasche in unmittelbarer Nachbarschaft zum aktiven Zentrum und könnte an der Erkennung verzweigter Substrate beteiligt sein. Die Röntgenstrukturanalyse der Maltosebindung liefert eine Erklärung für die einzigartige Transferspezifität des Enzyms. Durch gezielte ortsspezifische Mutagenesestudien konnten bisher weder die enzymatische Aktivität vollständig eliminiert, noch eine Modifizierung der spezifischen Transfereigenschaften erreicht werden. Es gelang jedoch eine Monomerisierung der MTase, wodurch die Thermoinaktivierungskinetik des Enzyms beschleunigt wurde. Neben den negativen Auswirkungen auf die Thermostabilisierung führte die Monomerisierung zu einem gesteigerten Hydrolyse/Transfer-Verhältnis im Vergleich zur Wildtyp-MTase.

Author dc:creator

• Raasch, Carsten

Contributors dc:contributor

• Liebl, Wolfgang Prof. Dr.
• Gottschalk, Gerhard Prof. Dr.

• 570 Biowissenschaften, Biologie
• Biologie
• Hydrolase
• Kofaktor
• ortsspezifische Mutagenese
• Thermostabilisierung
• Transferase
• 42.13
• 42.30
• WU

Licence

• https://webdoc.sub.gwdg.de/diss/copyrdiss.htm

Language dc:language

ger

Identifier

https://dx.doi.org/10.53846/goediss-73
urn:nbn:de:gbv:7-webdoc-1059-0
webdoc-1059
497824884

OAI identifier oai:identifier

oai:ediss.uni-goettingen.de:11858/00-1735-0000-0006-ABD3-F