Untersuchungen zur Identifikation von Interaktionspartnern der Nemo-like-Kinase, Nlk

Die Nemo-like-Kinase, Nlk, ist eine Serin-/Threonin-Kinase, die den MAP Kinase- mit dem Wnt Signaltransduktionsweg verbindet. Die einzigen bisher beschriebenen Interaktionspartner von Nlk sind β-Catenin, LEF-1, XTCF-3 und TCF-4. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde versucht, ein sogenanntes Säuger-2-Hybridsystem zu etablieren, anhand dessen neue Interaktionspartner von Nlk identifiziert werden sollten. Die Verwandtschaft mit Cyclin-abhängigen Kinasen (Cdks), die die inhibitorischen HLH Proteine Id2 und Id3 phosphorylieren, und die Beteiligung von HLH Transkriptionsfaktoren an der Entwicklung des Knochenmarks und des Zerebellums legten den Gedanken nahe, dass Id2 bzw. Id3 Interaktionspartner der Nlk sein könnten. Für das Säuger-2-Hybridsystem wurden diese potentiellen sowie bekannte Interaktionspartner als VP16-Fusionsproteine exprimiert. Anhand von Reportergenassays konnte gezeigt werden, dass die Co-Expression von Gal-Nlk mit jedem der VP16-Fusionsproteine in einer geringen Transkriptionsaktivierung resultiert. Dies deutet darauf hin, dass Nlk außer mit β-Catenin und LEF-1 auch mit Id2 bzw. Id3 interagieren könnte. Allerdings wird schon in Anwesenheit von Gal-Nlk allein eine verstärkte Expression des Reportergens registriert, so dass eine definitive Aussage über eine Interaktion nicht möglich ist. Aus diesem Grund wurden die Interaktionsstudien anhand von Co-Immunpräzipitationsexperimenten fortgesetzt. Es zeigte sich, dass Nlk sowohl mit Id2 als auch Id3 interagiert. Für Id3 konnte gezeigt werden, dass die Interaktion mit Nlk nicht von einer intakten katalytischen Nlk-Aktivität abhängig ist. Für β-Catenin hingegen war es in diesen Immunpräzpitationsexperimenten nicht möglich, eine Interaktion mit Nlk nachzuweisen. In der Western-Blot-Analyse zeigte sich, dass die Co-Expression mit Nlk zu einer Verringerung der nachweisbaren Menge von β-Cat Protein führt. Dieser Effekt ist von einer intakten katalytischen Nlk-Aktivität abhängig. Ferner konnte gezeigt werden, dass die Co-Expression von Wildtyp Nlk zu einer verminderten elektrophoretischen Mobilität von Id3-Protein in der SDS-PAGE führt. Die Co-Expression von kinase-negativen Nlk hingegen hat keinen Einfluss auf das Laufverhalten von Id3. Durch Behandlung der Zell-Lysate mit einer Protein-Phosphatase war es möglich, die langsamer migrierende Id3-Bande zu eliminieren. Somit induziert Nlk die Phosphorylierung von Id3 in vivo. Dieser Mechanismus könnte an einer Regulation der Interaktion von Id3 mit bHLH-Proteinen beteiligt sein.

Author dc:creator

• Schwer, Christian

Contributors dc:contributor

• Boehm, Thomas

• Nlk
• Id2
• Id3
• ß-Catenin
• LEF

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