{"id":{"repo_id":"freiburg-diss","oai_identifier":"oai:freidok.uni-freiburg.de:1482"},"canonical_url":"https://search.dev.ndltd.org/etd/freiburg-diss/oai:freidok.uni-freiburg.de:1482","repository":{"repo_id":"freiburg-diss","name":"University of Freiburg","base_url":"https://freidok.uni-freiburg.de/oai/oai2.php"},"display":{"title":"Untersuchungen zur Identifikation von Interaktionspartnern der Nemo-like-Kinase, Nlk","abstract":"Die Nemo-like-Kinase, Nlk, ist eine Serin-/Threonin-Kinase, die den MAP Kinase- mit dem Wnt Signaltransduktionsweg verbindet. Die einzigen bisher beschriebenen Interaktionspartner von Nlk sind β-Catenin, LEF-1, XTCF-3 und TCF-4. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde versucht, ein sogenanntes Säuger-2-Hybridsystem zu etablieren, anhand dessen neue Interaktionspartner von Nlk identifiziert werden sollten. Die Verwandtschaft mit Cyclin-abhängigen Kinasen (Cdks), die die inhibitorischen HLH Proteine Id2 und Id3 phosphorylieren, und die Beteiligung von HLH Transkriptionsfaktoren an der Entwicklung des Knochenmarks und des Zerebellums legten den Gedanken nahe, dass Id2 bzw. Id3 Interaktionspartner der Nlk sein könnten. Für das Säuger-2-Hybridsystem wurden diese potentiellen sowie bekannte Interaktionspartner als VP16-Fusionsproteine exprimiert. Anhand von Reportergenassays konnte gezeigt werden, dass die Co-Expression von Gal-Nlk mit jedem der VP16-Fusionsproteine in einer geringen Transkriptionsaktivierung resultiert. Dies deutet darauf hin, dass Nlk außer mit β-Catenin und LEF-1 auch mit Id2 bzw. Id3 interagieren könnte. Allerdings wird schon in Anwesenheit von Gal-Nlk allein eine verstärkte Expression des Reportergens registriert, so dass eine definitive Aussage über eine Interaktion nicht möglich ist. Aus diesem Grund wurden die Interaktionsstudien anhand von Co-Immunpräzipitationsexperimenten fortgesetzt. Es zeigte sich, dass Nlk sowohl mit Id2 als auch Id3 interagiert. Für Id3 konnte gezeigt werden, dass die Interaktion mit Nlk nicht von einer intakten katalytischen Nlk-Aktivität abhängig ist. Für β-Catenin hingegen war es in diesen Immunpräzpitationsexperimenten nicht möglich, eine Interaktion mit Nlk nachzuweisen. In der Western-Blot-Analyse zeigte sich, dass die Co-Expression mit Nlk zu einer Verringerung der nachweisbaren Menge von β-Cat Protein führt. Dieser Effekt ist von einer intakten katalytischen Nlk-Aktivität abhängig. Ferner konnte gezeigt werden, dass die Co-Expression von Wildtyp Nlk zu einer verminderten elektrophoretischen Mobilität von Id3-Protein in der SDS-PAGE führt. Die Co-Expression von kinase-negativen Nlk hingegen hat keinen Einfluss auf das Laufverhalten von Id3. Durch Behandlung der Zell-Lysate mit einer Protein-Phosphatase war es möglich, die langsamer migrierende Id3-Bande zu eliminieren. Somit induziert Nlk die Phosphorylierung von Id3 in vivo. Dieser Mechanismus könnte an einer Regulation der Interaktion von Id3 mit bHLH-Proteinen beteiligt sein.","abstract_html":"Die Nemo-like-Kinase, Nlk, ist eine Serin-/Threonin-Kinase, die den MAP Kinase- mit dem Wnt Signaltransduktionsweg verbindet. Die einzigen bisher beschriebenen Interaktionspartner von Nlk sind β-Catenin, LEF-1, XTCF-3 und TCF-4. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde versucht, ein sogenanntes Säuger-2-Hybridsystem zu etablieren, anhand dessen neue Interaktionspartner von Nlk identifiziert werden sollten. Die Verwandtschaft mit Cyclin-abhängigen Kinasen (Cdks), die die inhibitorischen HLH Proteine Id2 und Id3 phosphorylieren, und die Beteiligung von HLH Transkriptionsfaktoren an der Entwicklung des Knochenmarks und des Zerebellums legten den Gedanken nahe, dass Id2 bzw. 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Id3 interagieren könnte. Allerdings wird schon in Anwesenheit von Gal-Nlk allein eine verstärkte Expression des Reportergens registriert, so dass eine definitive Aussage über eine Interaktion nicht möglich ist. Aus diesem Grund wurden die Interaktionsstudien anhand von Co-Immunpräzipitationsexperimenten fortgesetzt. Es zeigte sich, dass Nlk sowohl mit Id2 als auch Id3 interagiert. Für Id3 konnte gezeigt werden, dass die Interaktion mit Nlk nicht von einer intakten katalytischen Nlk-Aktivität abhängig ist. Für β-Catenin hingegen war es in diesen Immunpräzpitationsexperimenten nicht möglich, eine Interaktion mit Nlk nachzuweisen. In der Western-Blot-Analyse zeigte sich, dass die Co-Expression mit Nlk zu einer Verringerung der nachweisbaren Menge von β-Cat Protein führt. Dieser Effekt ist von einer intakten katalytischen Nlk-Aktivität abhängig. Ferner konnte gezeigt werden, dass die Co-Expression von Wildtyp Nlk zu einer verminderten elektrophoretischen Mobilität von Id3-Protein in der SDS-PAGE führt. Die Co-Expression von kinase-negativen Nlk hingegen hat keinen Einfluss auf das Laufverhalten von Id3. Durch Behandlung der Zell-Lysate mit einer Protein-Phosphatase war es möglich, die langsamer migrierende Id3-Bande zu eliminieren. Somit induziert Nlk die Phosphorylierung von Id3 in vivo. Dieser Mechanismus könnte an einer Regulation der Interaktion von Id3 mit bHLH-Proteinen beteiligt sein.","Nemo-like kinase (Nlk) is a murine protein kinase related to Erk/MAP kinases and cyclin-directed kinases (Cdks). The Nlk amino acid sequence is 49.6% similar and 38.4% identical to human Cdc2. Nlk has been shown to connect MAP kinase and Wnt signalling pathways. The only published interaction partners so far are ß-catenin, LEF-1, XTCF-3 and TCF-4. In order to identify new interaction partners for Nlk, we tried to establish a so called mammalian-two-hybrid system. As candidate interaction partners, Id2 and Id3, both being substrates for Cdk2-dependent phosphorylation, were expressed as VP16-fusion proteins. Due to their already described interaction with Nlk, ß-catenin-VP16- and LEF-1-VP16-fusion proteins served as internal control. Reporter gene assays revealed that co-expression of Gal-Nlk with each of the VP16-fusion proteins results in a slightly enhanced transcriptional activation. These results indicate that Nlk may interact with Id2 and Id3. However, it should be noted that background activity was even high after expression of Gal-Nlk alone. To obtain further support for the interaction between Nlk and its possible partners, we continued our studies by performing immunoprecipitation assays. Both Id2 and Id3 could be detected in Nlk immunoprecipitates, indicating that Nlk interacts with Id2 and Id3. An interaction between Nlk and ß-catenin could not be detected in these experiments. Western-Blot analysis revealed that co-expression with Nlk results in decreased amounts of ß-catenin protein. This effect depends on an intact catalytic Nlk-activity. Furthermore, immunoblot analysis showed that Id3 protein migrated more slowly after co-expression with wild-type Nlk. The slowly migrating Id3 band was eliminated by phosphatase treatment. Consistent with this, expression of the kinase-negative mutant Nlk inhibited modification of Id3. 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Aus diesem Grund wurden die Interaktionsstudien anhand von Co-Immunpräzipitationsexperimenten fortgesetzt. Es zeigte sich, dass Nlk sowohl mit Id2 als auch Id3 interagiert. Für Id3 konnte gezeigt werden, dass die Interaktion mit Nlk nicht von einer intakten katalytischen Nlk-Aktivität abhängig ist. Für β-Catenin hingegen war es in diesen Immunpräzpitationsexperimenten nicht möglich, eine Interaktion mit Nlk nachzuweisen. In der Western-Blot-Analyse zeigte sich, dass die Co-Expression mit Nlk zu einer Verringerung der nachweisbaren Menge von β-Cat Protein führt. Dieser Effekt ist von einer intakten katalytischen Nlk-Aktivität abhängig. Ferner konnte gezeigt werden, dass die Co-Expression von Wildtyp Nlk zu einer verminderten elektrophoretischen Mobilität von Id3-Protein in der SDS-PAGE führt. Die Co-Expression von kinase-negativen Nlk hingegen hat keinen Einfluss auf das Laufverhalten von Id3. 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