Genetische und funktionale Vereinfachung eines komplexen Retrovirus am Beispiel des Primaten Foamy Virus Typ 1 (PFV-1)

Foamyviren (Spumaviridae) werden neuerdings von den übrigen Retroviren (Orthoretroviridae) abgegrenzt. Durch verschiedene Besonderheiten in ihrem Replikationszyklus, wie der Möglichkeit zur intrazellulären Retrotransposition oder der reversen Transkription spät im Vermehrungszyklus, nehmen sie eine funktionale Sonderstellung zwischen Retro-, Hepadnaviren und Retrotransposons ein. Aufgrund des Aufbaus ihres Genoms, das neben dem minimalen Gensatz der einfachen Retroviren Gag, Pro, Pol und Env noch zwei weitere akzessorische Leserahmen aufweist, werden sie zu den komplexen Retroviren gerechnet. Einer dieser zusätzlichen Leserahmen kodiert für den transkriptionalen Transaktivator Tas, der für die Replikation essentiell ist. Ein infektiöser Klon einer genetisch vereinfachten Variante des Primaten Foamy Virus Typ 1 (PFV-1) wurde konstruiert, der den konstitutiv aktiven immediate early gene (IE) Promotor und Enhancer des Cytomegalievirus (CMV) im Kontext einer hybriden LTR trägt. Dieses Konstrukt, sowie ein weiteres mit funktionaler Deletion des Tas-Gens führten nach Transfektion in Zellkulturen zur Freisetzung genetisch vereinfachter, infektiöser Viren, deren Replikationskompetenz und genetische Stabilität nachgewiesen wurde. Die rekombinanten Viren zeigten dabei um etwa drei lg-Stufen erniedrigte Virustiter im zellfreien Kulturüberstand und eine reduzierte Replikationskinetik. Versuche zur Steigerung der erreichbaren Virustiter durch thermisches Aufbrechen der Zellen, Inkubation mit dem demethylierenden Agens 5-Azacytidin (AZC) und Induktion mit dem Transkriptions-Stimulator Natriumbutyrat wurden unternommen, resultierten aber nicht in einer Steigerung der Freisetzung infektiöser Partikel oder der viralen Genexpression. Die Promotor-Aktivität der hybriden LTR wurde in einem transienten Reportergenassay unter Verwendung des Luciferasegens quantifiziert und war mit der der tas-stimulierten foamyviralen LTR vergleichbar. Eine Mutation des DD35E-Motivs im aktiven Zentrum der Integrase zu DA35E führte zur Replikationsunfähigkeit der vereinfachten Viren. Obwohl der Promotor eines nicht integrierenden Virus in die hybride LTR eingeführt wurde, blieb die Integration ein obligates Ereignis für die Replikation der Viren. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass eine genetische Vereinfachung des PFV-1 und Replikation mit einem heterologen Promotor in einer hybriden LTR möglich ist. Damit ist eine Voraussetzung für die Konstruktion PFV-basierter Vektoren zur Gentherapie unter Verwendung gewebespezifischer Promotoren gegeben.

Level thesis:degree_level

thesis.doctoral

Grantor dc:publisher

Universität Würzburg

Year

2001

Author dc:creator

• Schenk, Thomas

Contributors dc:contributor

• Rethwilm, Axel

• Virus
• Retrovirus
• Foamyvirus
• Spumavirus
• Genetik
• Vereinfachung
• Promotor
• Integration
• heterolog
• genetics
• simplification
• promoter
• heterologous

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