Etablierung und Charakterisierung einer Tetracyclin-induzierbaren PHD2-Knockdown-HeLa-Zelllinie

Prolyl-4-Hydroxylase-Domäne-Proteine 1-3 (PHD1-3) sind sauerstoffabhängige Enzyme, die den Hypoxie-induzierbaren Faktor (HIF-1α) hydroxylieren und damit für den Abbau markieren. HIF-1 ist ein Transkriptionsfaktor, der die Expression von mehr als 70 Genen reguliert, die im weitesten Sinne für die Sauerstoff- und Nährstoffversorgung essentiell sind. Unter Sauerstoffmangel sind die PHDs inaktiv, so dass die HIF-1α-Proteinlevel ansteigen und HIF-1-Zielgene, u. a. das Erythropoietin-Gen, induziert werden. PHD-Inhibitoren werden bereits in Phase-II-Studien getestet. Sie sollen unter anderem zur Therapie der chronischen Anämie bei niereninsuffizienten Patienten eingesetzt werden und die Gabe von rekombinantem EPO ersetzen. Es ist bisher wenig darüber bekannt, ob die PHDs neben der Regulation von HIF-1α noch weitere zelluläre Funktionen beeinflussen. Um HIF-unabhängige PHD-Substrate zu identifizieren und damit auch die Wirkungen und Nebenwirkungen von PHD-Inhibitoren besser einschätzen zu können, wurden Tetracyclin-induzierbare PHD2- und PHD3-Knockdown-Zelllinien etabliert und die Bedingungen für einen möglichst effizienten Knockdown optimiert. Weiterführend wurden die Zelllinien hinsichtlich ihrer Expression von PHD1-3 sowie HIF-1α und dessen Zielgen VEGF (vascular endothelial growth factor) charakterisiert. Im Vergleich zu PHD1 und PHD3 scheint PHD2 unter Normoxie die entscheidende Rolle für die HIF-1α-Regulation zu spielen. Daher wurde die Tetracyclin-induzierbare PHD2-Knockdown-HeLa-Zelllinie 2.1.1-16 genutzt, um PHD2-abhängige Transkriptom- und Proteomveränderungen (Gen-Array und 2D-Gelelektrophorese) zu untersuchen. In der Transkriptomanalyse konnten 7 Gene identifiziert werden, die in Abhängigkeit von dem PHD2-Knockdown unterschiedlich exprimiert werden, jedoch nicht hypoxisch induzierbar sind, d. h. höchstwahrscheinlich nicht durch HIF-1 reguliert werden. Von diesen 7 Genen sind 3 Gene hochreguliert (PGM2L1 (phosphoglucomutase 2 like 1), FAP (fibroblast activation protein, alpha) und PTPRE (protein tyrosine phosphatase, receptor type, E)) und 4 Gene herunterreguliert (AES (amino-terminal enhancer of split), RASSF2 (Ras association (RalGDS/AF-6) domain family 2), OASL (2"-5"-oligoadenylate synthetase-like) und TSPAN8 (tetraspanin8)). Interessanterweise haben die beschriebenen Gene einige Funktionen gemeinsam: Zellmotilität, Zelladhäsion, Angiogenese, Apoptose und die Aktivität von NF-κB werden teilweise in ähnlicher Weise beeinflusst. In der 2D-Gelelektrophorese wurde ein Proteinspot, der abhängig von dem PHD2-Knockdown reguliert wird, als Cofilin1 identifiziert. In unabhängigen Experimenten wurde bestätigt, dass Cofilin1 sowohl unter Normoxie als auch unter Hypoxie nach Induktion des PHD2-Knockdowns verstärkt in seiner phosphorylierten und damit inaktiven Form vorliegt. Cofilin1 hat einen fördernden Einfluss auf den Aktinfilament-Umbau und spielt damit eine wichtige Rolle für die Zytoskelettdynamik und Zellmotilität. In Übereinstimmung damit konnte nachgewiesen werden, dass die Induktion des PHD2-Knockdowns in 2.1.1-16-Zellen ein vermehrtes Vorliegen von Aktin-Stressfasern zur Folge hat. Außerdem wurde gezeigt, dass eine definierte Wunde im konfluenten Zellrasen bei 2.1.1-16-Zellen nach Induktion des PHD2-Knockdowns signifikant langsamer wieder zuwächst als bei den Vergleichsgruppen. Aufgrund der beschriebenen Ergebnisse kann vermutet werden, dass eine Inhibition von PHD2 unter anderem Einfluss auf Zellmotilität und Zelladhäsion hat. Inwiefern sich dies auf physiologische Vorgänge und pathophysiologische Prozesse wie Wundheilung und Metastasierung etc. auswirkt, muss weiter untersucht werden.

Author dc:creator

• Le-Huu, Sinja Kim-Anh

Contributors dc:contributor

• Katschinski, Dörthe Prof. Dr.
• Wienands, Jürgen Prof. Dr.
• Oppermann, Martin Prof. Dr.

• 610 Medizin, Gesundheit
• Medicine
• PHD Knockdown
• HIF
• Hypoxie
• Cofilin
• PHD knock down
• hypoxia
• 44.37

Licence

• https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/

Language dc:language

ger

Identifier

https://dx.doi.org/10.53846/goediss-818
urn:nbn:de:gbv:7-webdoc-2536-1
webdoc-2536
73789699X

OAI identifier oai:identifier

oai:ediss.uni-goettingen.de:11858/00-1735-0000-0006-AFA9-6