Mass Spectrometric Analyses of Post-Translationally Modified Proteins

Post-translationalen Modifikationen (PTMs) von Proteinen werden Schlüsselfunktionen für die Regulierung verschiedener zellulärer Prozesse zugeschrieben. In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene neue Methoden zur Identifizierung von PTMs, insbesondere von Phosphorylierungen, Glykosylierungen und SUMOylierungen, entwickelt. Die Arbeit behandelt fünf Themen: Kapitel 1 (General Introduction) erläutert den Begriff Proteomik und die Wichtigkeit der PTMs von Proteinen. Außerdem werden die wichtigsten Methoden der Proteomanalyse, einschließlich der Prinzipien der Protein- und Peptidtrennung, sowie die Theorie der Massenspektrometrie (MS) und das Konzept der Proteom-Datenanalyse erläutert. In Kapitel 2 (A High-Throughput Method for Phosphopeptide Enrichment of Spliceosomal Proteins and Its Application) wird eine Hochdurchsatz-Methode zur Anreicherung von Phophopeptiden spleißosomaler Proteine unter Verwendung einer selbsthergestellten Einweg-TiO2-Mikrospin-Säule beschrieben. Die vorgestellte Methode bietet verschiedene Vorteile wie den Hochdurchsatz, die leichte Anwendung, niedrige Kosten, hohe Selektivität und Sensitivität. In Kombination mit verschiedenen Proteomstrategien wurden 1381 einzigartige Phosphorylierungsstellen zugehörend zu 390 individuellen spleißosomalen Proteinen identifiziert. Ferner wurde diese Methode angewendet um Phosphorylierungsstellen der Proteine PRP6, PRP31 und SLP65 zu untersuchen und Protein-RNA-Interaktionen nach der UV-induzierten Quervernetzung zu erforschen. Kapitel 3 ( Efficient Enrichment of Intact Phosphoproteins prior to Mass Spectrometric Analysis ) befasst sich mit einem zielgerichteten und verlässlichen Verfahren der Phosphoprotein-Anreicherung, welches auf der Kalziumphosphat-Präzipitation (CPP) basiert. Durch Einbindung der TiO2-Mikrospin-Säule wurden insgesamt 192 einzigartige Phosphorylierungsstellen zugehörend zu 45 individuellen Proteinen des U1 snRNPs (small nuclear ribonucleoprotein particles) identifiziert. Von diesen waren 59 Phosphorylierungsstellen bisher unbekannt. Kapitel 4 (Pseudo-Neutral-Loss Scan for Selective Detection of Phosphopeptides and N-Glycopeptides using Liquid Chromatography Coupled with a Hybrid Linear Ion-Trap/Orbitrap Mass Spectrometer) beschreibt eine Pseudo-Neutralverlust-Analyse an einem Hybrid-LTQ-Orbitrap Massenspektrometer für die selektive Analyse von Phosphopeptiden und Glykopeptiden. Bei Anwesenheit bekannter, charakteristischer Massenpaare (Phosphorsäure oder Monosaccharid-Reste) im Massenspektrum während der kollisions-induzierten Dissoziation (colision induced decay, CID) wurde die Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) sowie die mehrstufig aktivierte Tandem-Massenspektrometrie (multi-stage activation MS3 fragmentation) eingeleitet. Diese Methode ist kompatibel mit der nano-Flüssigkeitschromatographie (nano-LC) für die Trennung komplexer Peptidmischungen und erfordert keine weitere Anreicherung. Die resultierenden Spektren liefern die Peptidsequenz und Modifizierungsstellen, sowie Informationen über die Glykanstruktur. Kapitel 5 ( ChopNSpice , a Mass Spectrometric Approach That Allows Identification of Endogenous Small Ubiquitin-like Modifier-conjugated Peptides) beschreibt ein neues, benutzerfreundliches und zielgerichtetes Serviceprogramm (genannt ChopNSpice ) für die Datenbanksuche um die SUMO1- und SUMO2/3-Konjugationsstellen von Säugetieren in vitro und in vivo mittels Massenspektrometrie in Kombination mit Suchmaschinen wie MASCOT oder Sequest eindeutig zu bestimmen. Die datenabhängige Aufnahme (data dependent acquisition, DDA) hoher Massen ist sehr geeignet für die genaue Detektion und Sequenzierung großer Peptide und erleichtert außerdem die Detektion niedrig-abundanter SUMO-Konjugate. Wir haben die Leistungsfähigkeit der ChopNSpice-Software in Kombination mit einer Proteomstudie gezeigt - mit dem Ergebnis der Identizierung von 10 SUMOylierten Proteinen in HeLa-S3-Zellen mit 17 eindeutigen Modifizierungsstellen. Von diesen waren 15 SUMOylierungsstellen bisher nicht bekannt und stellen nun eine nützliche Quelle für die biologische Forschungsgemeinschaft dar.

Author dc:creator

• Hsiao, He-Hsuan

Contributors dc:contributor

• Urlaub, Henning Dr.
• Ficner, Ralf Prof. Dr.
• Melchior, Frauke Prof. Dr.

• 500 Naturwissenschaften
• Biologie
• ChopNSpice
• Kalziumphosphat-Präzipitation (CPP)
• Glykosylierungen
• Massenspektrometrie (MS)
• Phosphorylierungen
• Post-translationalen Modifikationen (PTMs)
• Pseudo-Neutral-Loss Scan
• SUMOylierungen
• Calcium Phosphate Precipitation (CPP)
• Glycosylation
• Mass Spectrometry (MS)
• Phosphorylation
• Post-Translational Modifications (PTMs)
• SUMOylation
• 58.3
• WA 320: Spektroskopie {Biologie}
• WA 330: Chromatographie {Biologie}
• WA 340: Elektrophorese {Biologie}

Licence

• https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/

Language dc:language

eng

Identifier

https://dx.doi.org/10.53846/goediss-415
urn:nbn:de:gbv:7-webdoc-2761-1
webdoc-2761
664238165

OAI identifier oai:identifier

oai:ediss.uni-goettingen.de:11858/00-1735-0000-0006-ADDD-D