Structural and functional analysis of exportin-cargo recognition

Jeglicher Stoffaustausch zwischen Zellkern und Zellplasma verläuft über sogenannte Kernporenkomplexe gigantische in die Kernhülle eingebettete Kanäle. Der Großteil des Kerntransports wird durch Ran-abhängige Rezeptoren der Importin β-Familie vermittelt, welche Import-Rezeptoren ( Importine ) und Exportine umfasst. Importin 13 und Msn5p sind Ausnahmen, da sie sowohl Import als auch Export vermitteln. In dieser Arbeit haben wir gezeigt, dass Exportin 4, zusätzlich zu seiner etablierten Rolle als Export-Rezeptor, Transkriptionsfaktoren der Sox-Familie importiert.CRM1 (auch Exportin 1 genannt) ist das mit Abstand vielseitigste Exportin der Zelle: CRM1 erkennt eine enorme Vielzahl strukturell verschiedener Fracht-Proteine ( Kargos ). Wie diese bemerkenswerte Multispezifität bewerkstelligt wird und wie Ran die Kargo-Beladung von CRM1 auslöst, war bislang unbekannt. Die kristallographische Analyse von CRM1-Exportkomplexen wurde vor allem durch deren Instabilität erschwert. In dieser Arbeit habe ich Konstrukte und Bedingungen zur Rekonstitution chromatographisch stabiler und homogener CRM1-Exportkomplexe etabliert. Diese ermöglichten uns schließlich, die Kristallstruktur des Snurportin1⋅CRM1⋅RanGTP-Komplexes zu lösen. Snurportin bindet CRM1 mit außergewöhnlich hoher Affinität. Die Struktur zeigt, dass Ran diese Kargo-Bindung ausschließlich über eine Konformationsänderung in CRM1 herbeiführen kann. CRM1 bindet Snurportins komplexes, dreiteiliges Exportsignal, welches unter anderem eine gefaltete Domäne umfasst, in überraschender Weise.Deutlich einfachere CRM1-abhängige Export-Signaturen sind die sogenannten Leucin-reichen Exportsignale (engl. NESs für nuclear export signals ) eine heterogene Klasse von Peptiden, die charakteristische Muster hydrophober (Φ) Reste enthalten. NES-artige Sequenzen sind weit verbreitet selbst in Proteinen, die nicht durch CRM1 erkannt werden: So zeigt diese Arbeit, dass das vormals beschriebene NES-Peptid der Abelson (Abl)-Tyrosinkinase in Isolation funktionell ist, jedoch im Kontext der C-terminalen Domäne von Abl keinen CRM1-abhängigen Export vermittelt, da hier kritische Φ-Reste im hydrophoben Zentrum vergraben liegen. Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass strukturelle Informationen für eine korrekte Vorhersage von Exportsignalen unabdingbar sind. Um zu entschlüsseln wie CRM1 unterschiedlichste NES-Peptide erkennen kann, haben wir eine auf NES-Snurportin1-Chimären basierende kristallographische Strategie entwickelt und umgesetzt. Es gelang uns, die Kristallstrukturen des freien und des PKI (Proteinkinase A-Inhibitor) NES- bzw. HIV-1 Rev NES-gebundenen RanGTP⋅CRM1-Komplexes zu lösen. Obwohl sich die betrachteten NES-Peptide drastisch im Abstand ihrer Φ-Reste unterscheiden, erkennt Ran-gebundenes CRM1 all diese Signale mit demselben Satz an fünf Φ-Taschen. Diese Taschen sind starr, doch NES-Peptide kompensieren ihre unterschiedlichen Φ-Abstände, indem sie verschiedene CRM1-gebundende Konformationen einnehmen. Unsere NMR-Analyse des freien bzw. CRM1-gebundenen PKI NES-Peptids lässt vermuten, dass CRM1 dabei bereits vorliegende NES-Konformere für die hochaffine Bindung selektiert. Jede der Φ-Taschen akzeptiert eine Vielzahl unterschiedlicher hydrophober Reste, wobei einzelne Φ-Reste entbehrlich sind, sofern sie sich in einem nahezu optimalen Φ-Kontext befinden. Dies erklärt die enorme Flexibilität der CRM1⋅NES-Erkennung und zeigt einen neuen strukturbasierten NES-Konsensus auf, der Vorhersagen der NES-CRM1-Affinität ermöglicht.

Author dc:creator

• Güttler, Thomas

Contributors dc:contributor

• Görlich, Dirk Prof. Dr.
• Ficner, Ralf Prof. Dr.
• Lührmann, Reinhard Prof. Dr.

• 570 Biowissenschaften, Biologie
• Biologie
• Kerntransport
• Kernexport
• Kernexportsignal
• NES
• Exportin
• CRM1
• Kernimport
• Importin
• Sox-Protein
• nuclear transport
• nuclear export
• nuclear export signal
• nuclear import
• Sox protein
• 42.15
• 35.76
• 35.25
• WHC 300: Zellkern {Cytologie}
• SXC 000: Struktur von Biomolekülen {Biochemie}
• SXL 440: Struktur {Biochemie}
• WF 200: Molekularbiologie

Licence

• https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/

Language dc:language

eng

Identifier

https://dx.doi.org/10.53846/goediss-398
urn:nbn:de:gbv:7-webdoc-2694-3
webdoc-2694
663666112

OAI identifier oai:identifier

oai:ediss.uni-goettingen.de:11858/00-1735-0000-0006-ADCC-4