Fluoreszenzmikroskopische Studien an Plasmamembranen zur Untersuchung der molekularen Mechanismen der neuronalen Exocytose

Bei der regulierten Exocytose in Neuronen und neuroendokrinen Zellen führt ein intrazellulärer Anstieg der Calciumkonzentration zur Core-Komplexbildung zwischen den plasmamembranständigen SNAREs Syntaxin1A und SNAP-25 und dem vesikelassoziierten SNARE Synaptobrevin. Dadurch werden die gegenüberliegenden Membranen fusioniert. Neben den SNAREs ist auch Munc18-1, das zur Sec1/Munc18-Proteinfamilie gehört, ein essentielles Protein der neuronalen Exocytose. Der Munc18-1-Knockout führt zum Block der neuronalen Exocytose. In vitro bildet Munc18-1 mit Syntaxin1 einen Komplex, der Syntaxin1 in einer sogenannten geschlossenen Konformation hält. In diesem Komplex ist Syntaxin1 für Reaktionen mit SNAP-25 und Synaptobrevin2 unzugänglich, so dass keine Core-Komplexbildung mehr stattfinden kann. Wie diese Inhibition der Core-Komplexbildung mit der essentiellen Munc18-1-Funktion zusammenpasst ist bisher nicht verstanden. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass Munc18-1 in intakten und exocytosekompetenten Plasmamembranpräparationen von PC12-Zellen mit membrangebundenem Syntaxin1 einen Komplex bildet. Aus diesem Komplex heraus kann Munc18-1 durch Zugabe von rekombinantem Synaptobrevin2, welches Core-Komplexe mit den endogenen SNAREs bildet, gelöst werden. Wurde das Experiment unter gleichen Bedingungen, jedoch statt unter Zugabe von Synaptobrevin2 unter Zugabe von rekombinantem Syntaxin1A bzw. SNAP-25, die keine Core-Komplexe an der Membran bilden, durchgeführt, verblieb Munc18-1 an Syntaxin1 gebunden. Zur Kontrolle wurde dieses Experiment auch an Membranen von SNAP-25-defizienten Mäusen durchgeführt. Da hier grundsätzlich keine Core-Komplexbildung stattfindet, konnte, wie erwartet, keine Freisetzung von Munc18-1 durch Synaptobrevin2 beobachtet werden. Dies untermauert, dass in der nativen Membran Syntaxin1 trotz seiner Munc18-1-Bindung für die Core-Komplexbildung zur Verfügung steht und dass sich Munc18-1 nach dieser Komplexbildung von Syntaxin1 löst. Daraus wird geschlossen, dass Munc18-1 die Bildung eines Komplexes zwischen Syntaxin1 und SNAP-25 erlaubt, der ein Akzeptor für vesikuläres Synaptobrevin ist und somit ein Intermediat der Exocytose darstellt. Die Munc18-1-Syntaxin-Bindung könnte ein räumlicher und zeitlicher Regulator dieses Intermediates sein und die Bildung unproduktiver SNARE-Komplexe in der Plasmamembran verhindern. Im Rahmen dieser Dissertation wurde außerdem untersucht, ob sich eine Erhöhung der Calciumkonzentration auf den Zustand der SNAREs auswirkt, welche unter Ruhebedingungen unkomplexiert und in Mikrodomänen aufkonzentriert sind. Es konnte gezeigt werden, dass bei erhöhten physiologischen Calcium-Konzentrationen eine starke Abnahme der Antigenizität der SNAREs zu beobachten ist: Für Syntaxin1 war bei gleichzeitiger Abnahme der Antigenizität eine gesteigerte Aufkonzentration in Domänen erkennbar. Für SNAP-25 wurde ein Abfall der Immunreaktivität um 90% beobachtet. Rekombinantes Synaptobrevin2 wurde deutlich schlechter in die Membran eingebaut. Diese Erkenntnisse lassen folgende Interpretationen zu: Durch Calcium kommt es zur Umorganisation von Syntaxin-Domänen. Da das Epitop zur Anfärbung von SNAP-25 innerhalb dessen SNARE-Motivs liegt, könnte die starke Abnahme der Immunreaktivität den Einbau von SNAP-25 in Syntaxin-SNAP-25-Komplexe widerspiegeln. Dies wird dadurch untermauert, dass nach Calciumbehandlung weniger rekombinantes Synaptobrevin mit den endogenen SNAREs reagiert.

Author dc:creator

• Zilly, Felipe Emilio

Contributors dc:contributor

• Jahn, Reinhard Prof. Dr.
• Hardeland, Rüdiger Prof. Dr.

• 570 Biowissenschaften, Biologie
• Biologie
• SNARE
• Syntaxin
• Munc18
• Exocytose
• PC12
• exocytosis
• 35.70
• 42.13
• 42.15
• WHC 100: Zellmembranen, Zelloberfläche, Zellwand, intrazelluläre Membranen {Cytologie}
• WHF 800: Permeabilität, inter- und intrazellulärer Transport {Cytologie}

Licence

• https://webdoc.sub.gwdg.de/diss/copyr_diss.html

Language dc:language

ger

Identifier

https://dx.doi.org/10.53846/goediss-152
urn:nbn:de:gbv:7-webdoc-1284-6
webdoc-1284
517917025

OAI identifier oai:identifier

oai:ediss.uni-goettingen.de:11858/00-1735-0000-0006-AC23-6