Entwicklung eines fluoreszenz-optischen Evaneszenzfeldmesssystems für die Echtzeitanalyse von DNA-Mikroarrays

In dieser Arbeit ist das Messprinzip der Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) auf die Mikroarraytechnologie übertragen, angepasst und optimiert worden, um Hybridisierungsereignisse auf DNA-Mikroarrays in Echtzeit analysieren zu können. Dazu wurden verschiedene (mikro)-optische Auflicht- und Evaneszenzfeldanregungsmechanismen experimentell untersucht und es wurden theoretische Berechnungen zur Fluoreszenzemission durchgeführt. <br>Mit einer Methode, die auf einer optimierten Lichtführung der mehrfachen Totalreflexion zwischen Grenzflächen in einem Standard-Objektträger basiert, konnte demonstriert werden, dass bis zu 4000 Messpunkte auf einem Mikroarray mit einem Durchmesser von ca. 150 µm und einem Raster von 500 µm mit gleichförmiger evaneszenter Intensität angeregt werden können, und dass die Auslesung der Fluoreszenzemission mit einer CCD-Kamera möglich ist. Das Zustandekommen der gleichförmigen Ausleuchtung auf der Chipoberfläche konnte durch eine strahloptische Simulation bestätigt werden. <br>Mit dem TIRF-Transducer mit mehrfacher Totalreflexion wurde demonstriert, dass die experimentelle Bestimmung von Reaktionskinetiken zwischen immobilisierten Oligonukleotidsonden und DNA-Proben möglich ist. Dazu wurde der zeitliche Anbindungsverlauf von in Lösung befindlichen Cy5-markierten 30-mer Oligonukleotidsequenzen bei den Konzentrationen 10 nM, 50 nM, 100 nM, 500 nM an vollständig komplementäre 30-mer Oligonukleotidsonden aufgenommen. Mit den aufgenommenen Messdaten konnten die Geschwindigkeitskonstanten der Anbindung kon= 4.48 ± 0.07 × 10^5 × M^-1 × s^-1 , der Ablösung koff = 7.75 ± 1.83 × 10^-3 × s^-1 und die Affinitätskonstante Kaff = 0.58 × 10^8 × M^-1 ermittelt werden, die gut mit Literaturwerten übereinstimmen. Eine Konzentration von mindestens C = 1 pM konnte bei einer Aufnahmedauer von 60 s nachgewiesen werden.

Author dc:creator

• Lehr, Hans-Peter

Contributors dc:contributor

• Menz, Wolfgang

• Echtzeitanalyse
• Evaneszenzfeld
• TIRF
• Reaktionskinetik
• DNA
• Total Internal Reflection Fluorescence
• Microarray
• Real time detection
• Hybridization

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