{"id":{"repo_id":"freiburg-diss","oai_identifier":"oai:freidok.uni-freiburg.de:598"},"canonical_url":"https://search.dev.ndltd.org/etd/freiburg-diss/oai:freidok.uni-freiburg.de:598","repository":{"repo_id":"freiburg-diss","name":"University of Freiburg","base_url":"https://freidok.uni-freiburg.de/oai/oai2.php"},"display":{"title":"Entwicklung eines fluoreszenz-optischen Evaneszenzfeldmesssystems für die Echtzeitanalyse von DNA-Mikroarrays","abstract":"In dieser Arbeit ist das Messprinzip der Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) auf die Mikroarraytechnologie übertragen, angepasst und optimiert worden, um Hybridisierungsereignisse auf DNA-Mikroarrays in Echtzeit analysieren zu können. Dazu wurden verschiedene (mikro)-optische Auflicht- und Evaneszenzfeldanregungsmechanismen experimentell untersucht und es wurden theoretische Berechnungen zur Fluoreszenzemission durchgeführt. <br>Mit einer Methode, die auf einer optimierten Lichtführung der mehrfachen Totalreflexion zwischen Grenzflächen in einem Standard-Objektträger basiert, konnte demonstriert werden, dass bis zu 4000 Messpunkte auf einem Mikroarray mit einem Durchmesser von ca. 150 µm und einem Raster von 500 µm mit gleichförmiger evaneszenter Intensität angeregt werden können, und dass die Auslesung der Fluoreszenzemission mit einer CCD-Kamera möglich ist. Das Zustandekommen der gleichförmigen Ausleuchtung auf der Chipoberfläche konnte durch eine strahloptische Simulation bestätigt werden. <br>Mit dem TIRF-Transducer mit mehrfacher Totalreflexion wurde demonstriert, dass die experimentelle Bestimmung von Reaktionskinetiken zwischen immobilisierten Oligonukleotidsonden und DNA-Proben möglich ist. Dazu wurde der zeitliche Anbindungsverlauf von in Lösung befindlichen Cy5-markierten 30-mer Oligonukleotidsequenzen bei den Konzentrationen 10 nM, 50 nM, 100 nM, 500 nM an vollständig komplementäre 30-mer Oligonukleotidsonden aufgenommen. Mit den aufgenommenen Messdaten konnten die Geschwindigkeitskonstanten der Anbindung kon= 4.48 ± 0.07 × 10^5 × M^-1 × s^-1 , der Ablösung koff = 7.75 ± 1.83 × 10^-3 × s^-1 und die Affinitätskonstante Kaff = 0.58 × 10^8 × M^-1 ermittelt werden, die gut mit Literaturwerten übereinstimmen. Eine Konzentration von mindestens C = 1 pM konnte bei einer Aufnahmedauer von 60 s nachgewiesen werden.","abstract_html":"In dieser Arbeit ist das Messprinzip der Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) auf die Mikroarraytechnologie übertragen, angepasst und optimiert worden, um Hybridisierungsereignisse auf DNA-Mikroarrays in Echtzeit analysieren zu können. Dazu wurden verschiedene (mikro)-optische Auflicht- und Evaneszenzfeldanregungsmechanismen experimentell untersucht und es wurden theoretische Berechnungen zur Fluoreszenzemission durchgeführt. &lt;br&gt;Mit einer Methode, die auf einer optimierten Lichtführung der mehrfachen Totalreflexion zwischen Grenzflächen in einem Standard-Objektträger basiert, konnte demonstriert werden, dass bis zu 4000 Messpunkte auf einem Mikroarray mit einem Durchmesser von ca. 150 µm und einem Raster von 500 µm mit gleichförmiger evaneszenter Intensität angeregt werden können, und dass die Auslesung der Fluoreszenzemission mit einer CCD-Kamera möglich ist. Das Zustandekommen der gleichförmigen Ausleuchtung auf der Chipoberfläche konnte durch eine strahloptische Simulation bestätigt werden. &lt;br&gt;Mit dem TIRF-Transducer mit mehrfacher Totalreflexion wurde demonstriert, dass die experimentelle Bestimmung von Reaktionskinetiken zwischen immobilisierten Oligonukleotidsonden und DNA-Proben möglich ist. 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Dazu wurden verschiedene (mikro)-optische Auflicht- und Evaneszenzfeldanregungsmechanismen experimentell untersucht und es wurden theoretische Berechnungen zur Fluoreszenzemission durchgeführt. <br>Mit einer Methode, die auf einer optimierten Lichtführung der mehrfachen Totalreflexion zwischen Grenzflächen in einem Standard-Objektträger basiert, konnte demonstriert werden, dass bis zu 4000 Messpunkte auf einem Mikroarray mit einem Durchmesser von ca. 150 µm und einem Raster von 500 µm mit gleichförmiger evaneszenter Intensität angeregt werden können, und dass die Auslesung der Fluoreszenzemission mit einer CCD-Kamera möglich ist. Das Zustandekommen der gleichförmigen Ausleuchtung auf der Chipoberfläche konnte durch eine strahloptische Simulation bestätigt werden. <br>Mit dem TIRF-Transducer mit mehrfacher Totalreflexion wurde demonstriert, dass die experimentelle Bestimmung von Reaktionskinetiken zwischen immobilisierten Oligonukleotidsonden und DNA-Proben möglich ist. Dazu wurde der zeitliche Anbindungsverlauf von in Lösung befindlichen Cy5-markierten 30-mer Oligonukleotidsequenzen bei den Konzentrationen 10 nM, 50 nM, 100 nM, 500 nM an vollständig komplementäre 30-mer Oligonukleotidsonden aufgenommen. Mit den aufgenommenen Messdaten konnten die Geschwindigkeitskonstanten der Anbindung kon= 4.48 ± 0.07 × 10^5 × M^-1 × s^-1 , der Ablösung koff = 7.75 ± 1.83 × 10^-3 × s^-1 und die Affinitätskonstante Kaff = 0.58 × 10^8 × M^-1 ermittelt werden, die gut mit Literaturwerten übereinstimmen. Eine Konzentration von mindestens C = 1 pM konnte bei einer Aufnahmedauer von 60 s nachgewiesen werden.","The principle of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) has been transformed and optimized to detect and analyze hybridization events on fluorescent-labeled DNA-microarrays in real time. A sensing configuration based on epi-illumination and three TIRF-sensing configurations using two bulk and one integrated optical planar waveguide as transducer platforms for oligonucleotide microarrays have been investigated. Calculations for the theoretical estimation of the fluorescent light emission were performed. <br>With an optimized internal reflection arrangement inside standard-microscope-slides it has been experimentally demonstrated, that up to 4000 spots with a diameter of ~150 µm and a pitch of 500 µm can be excitated with an uniform evanescent illumination. The readout is achieved with a CCD-camera. The uniform evanescent illumination was confirmed by ray-tracing-simulation. With a readout system based on the multiple internal reflection TIRF-transducer it has been demonstrated experimentally, that it is possible to observe hybridization events in real time and to derive reaction kinetics parameters. The hybridization of Cy5-la-beled 30-mer single-stranded oligonucleotides to fully complementary immobilized strands were recorded in real-time. From the extracted image data the association rate kon = 4.48 ± 0.07 × 10^5 × M^-1 x s^-1 , the dissociation rate koff = 7.75 ± 1.83 × 10^-3 × s^-1 and the affinity rate Kaff = 0.58 × 10^8 × M^-1 were derived. 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A sensing configuration based on epi-illumination and three TIRF-sensing configurations using two bulk and one integrated optical planar waveguide as transducer platforms for oligonucleotide microarrays have been investigated. Calculations for the theoretical estimation of the fluorescent light emission were performed. <br>With an optimized internal reflection arrangement inside standard-microscope-slides it has been experimentally demonstrated, that up to 4000 spots with a diameter of ~150 µm and a pitch of 500 µm can be excitated with an uniform evanescent illumination. The readout is achieved with a CCD-camera. The uniform evanescent illumination was confirmed by ray-tracing-simulation. With a readout system based on the multiple internal reflection TIRF-transducer it has been demonstrated experimentally, that it is possible to observe hybridization events in real time and to derive reaction kinetics parameters. The hybridization of Cy5-la-beled 30-mer single-stranded oligonucleotides to fully complementary immobilized strands were recorded in real-time. From the extracted image data the association rate kon = 4.48 ± 0.07 × 10^5 × M^-1 x s^-1 , the dissociation rate koff = 7.75 ± 1.83 × 10^-3 × s^-1 and the affinity rate Kaff = 0.58 × 10^8 × M^-1 were derived. Signals from the hybridization of Cy5-labeled 30-mer oligonucleotides of 1 pM could be detected."],"dc:format.medium":["application/pdf"],"dc:subject":["Echtzeitanalyse","Evaneszenzfeld","TIRF","Reaktionskinetik","DNA","Total Internal Reflection Fluorescence","Microarray","Real time detection","Hybridization"],"dc:title":["Entwicklung eines fluoreszenz-optischen Evaneszenzfeldmesssystems für die Echtzeitanalyse von DNA-Mikroarrays","Development of an optical readout system based on total internal reflection fluorescence for the real-time-analysis of DNA-microarrays"],"dc:type":["DoctoralThesis"]},"updated_at":"2026-07-24T02:21:46Z"}