Design, Herstellungsoptimierung, Charakterisierung und Anwendung einer randomisierten, auf Adeno-assoziierten Viren exprimierten Peptidbank

Eine Verbesserung der Effizienz und Spezifität der bisher verfügbaren Gentherapievektoren ist eine notwendige Voraussetzung für den Einsatz und Erfolg der Gentherapie. Durch das Targeting zelltypspezifischer Rezeptoren könnten Vektoren spezifisch auf bestimmte Zelltypen umgelenkt werden. Dadurch könnte die Effektivität des Vektors im Zielgewebe erhöht und gleichzeitig gesundes Gewebe verschont werden. <br>In der vorliegenden Arbeit wird die Etablierung, Charakterisierung und erste Anwendung einer neuen Methode zur Selektion zellspezifisch bindender Gentherapievektoren dargelegt. Basis dieser Methode des Targetings bilden Adeno-assoziierten Viren (AAV), die an der Oberfläche randomisierte Peptidliganden exprimieren, welche ein Umlenken der Vektoren von ihrem natürlichen auf einen alternativen Rezeptor ermöglichen. Die Peptidliganden werden in der Region des Capsidproteins exprimiert, die an der Bindung von Wildtyp-AAV an den natürlichen Rezeptor Heparansulfat-Proteoglykan (HSPG) beteiligt ist. Dadurch wird einerseits die Bindung an HSPG abgeschwächt, andererseits ein neuer Bindungstropismus geschaffen. Ziel dieser Arbeit war die Herstellung einer "AAV-Kollektion", in der jedes Virus an der Oberfläche ein anderes, in der Sequenz randomisiertes Oligopeptid trägt, eine randomisierte AAV-Peptidbank. <br>Zur Herstellung dieser randomisierten Peptidbank wurde ein 3-Schritt-System (randomisierte Plasmidbank, Transfershuttles, randomisierte Peptidbank) angewandt, welches ermöglichte, dass die auf der Capsidoberfläche präsentierten, randomisierten Oligopeptide auch von dem verpackten Virusgenom codiert werden. Um auf diese Weise eine Peptidbank mit einer für Selektionsversuche ausreichenden Diversität (Zahl verschiedener, einzigartig vorkommender Capsidmutanten) herzustellen, mussten zahlreiche Optimierungen der einzelnen Herstellungsschritte vorgenommen werden. Ergebnis dieser Optimierungen war eine <br>AAV-Peptidbank mit circa 108 einzigartig vorkommenden Peptidklonen, aus der in Selektionsversuchen AAV-Klone bzw. mutierte Capside isoliert werden können, die auf Grund ihres eingefügten, randomisierten Peptids die Fähigkeit besitzen an einen auf der Oberfläche exprimierten Rezeptor zu binden und zu internalisieren. <br>In Selektionsexperimenten auf vier verschiedenen Leukämiezelllinien konnten über drei Selektionsrunden verschiedene AAV-Peptidklone der Peptidbank angereichert werden, die gemeinsame Sequenzmuster (Motive) teilten. Da die Selektion bei dieser Methode im Capsidprotein-Kontext potentieller Gentherapievektoren durchgeführt wird, weist sie gegenüber anderen bislang angewandten Methoden des Vektortargetings entscheidende Vorteile auf und hat ein großes Anwendungspotential in der Biotechnologie und Medizin.

Author dc:creator

• Kaul, Felix

• Adeno-assoziierte Viren (Typ 2)
• randomisierte Peptidbank
• Targeting
• adenoi-assocaited virus (type 2)
• random peptide library
• capsid mutation

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