{"id":{"repo_id":"freiburg-diss","oai_identifier":"oai:freidok.uni-freiburg.de:1789"},"canonical_url":"https://search.dev.ndltd.org/etd/freiburg-diss/oai:freidok.uni-freiburg.de:1789","repository":{"repo_id":"freiburg-diss","name":"University of Freiburg","base_url":"https://freidok.uni-freiburg.de/oai/oai2.php"},"display":{"title":"Design, Herstellungsoptimierung, Charakterisierung und Anwendung einer randomisierten, auf Adeno-assoziierten Viren exprimierten Peptidbank","abstract":"Eine Verbesserung der Effizienz und Spezifität der bisher verfügbaren Gentherapievektoren ist eine notwendige Voraussetzung für den Einsatz und Erfolg der Gentherapie. Durch das Targeting zelltypspezifischer Rezeptoren könnten Vektoren spezifisch auf bestimmte Zelltypen umgelenkt werden. Dadurch könnte die Effektivität des Vektors im Zielgewebe erhöht und gleichzeitig gesundes Gewebe verschont werden. <br>In der vorliegenden Arbeit wird die Etablierung, Charakterisierung und erste Anwendung einer neuen Methode zur Selektion zellspezifisch bindender Gentherapievektoren dargelegt. Basis dieser Methode des Targetings bilden Adeno-assoziierten Viren (AAV), die an der Oberfläche randomisierte Peptidliganden exprimieren, welche ein Umlenken der Vektoren von ihrem natürlichen auf einen alternativen Rezeptor ermöglichen. Die Peptidliganden werden in der Region des Capsidproteins exprimiert, die an der Bindung von Wildtyp-AAV an den natürlichen Rezeptor Heparansulfat-Proteoglykan (HSPG) beteiligt ist. Dadurch wird einerseits die Bindung an HSPG abgeschwächt, andererseits ein neuer Bindungstropismus geschaffen. Ziel dieser Arbeit war die Herstellung einer \"AAV-Kollektion\", in der jedes Virus an der Oberfläche ein anderes, in der Sequenz randomisiertes Oligopeptid trägt, eine randomisierte AAV-Peptidbank. <br>Zur Herstellung dieser randomisierten Peptidbank wurde ein 3-Schritt-System (randomisierte Plasmidbank, Transfershuttles, randomisierte Peptidbank) angewandt, welches ermöglichte, dass die auf der Capsidoberfläche präsentierten, randomisierten Oligopeptide auch von dem verpackten Virusgenom codiert werden. Um auf diese Weise eine Peptidbank mit einer für Selektionsversuche ausreichenden Diversität (Zahl verschiedener, einzigartig vorkommender Capsidmutanten) herzustellen, mussten zahlreiche Optimierungen der einzelnen Herstellungsschritte vorgenommen werden. Ergebnis dieser Optimierungen war eine <br>AAV-Peptidbank mit circa 108 einzigartig vorkommenden Peptidklonen, aus der in Selektionsversuchen AAV-Klone bzw. mutierte Capside isoliert werden können, die auf Grund ihres eingefügten, randomisierten Peptids die Fähigkeit besitzen an einen auf der Oberfläche exprimierten Rezeptor zu binden und zu internalisieren. <br>In Selektionsexperimenten auf vier verschiedenen Leukämiezelllinien konnten über drei Selektionsrunden verschiedene AAV-Peptidklone der Peptidbank angereichert werden, die gemeinsame Sequenzmuster (Motive) teilten. Da die Selektion bei dieser Methode im Capsidprotein-Kontext potentieller Gentherapievektoren durchgeführt wird, weist sie gegenüber anderen bislang angewandten Methoden des Vektortargetings entscheidende Vorteile auf und hat ein großes Anwendungspotential in der Biotechnologie und Medizin.","abstract_html":"Eine Verbesserung der Effizienz und Spezifität der bisher verfügbaren Gentherapievektoren ist eine notwendige Voraussetzung für den Einsatz und Erfolg der Gentherapie. Durch das Targeting zelltypspezifischer Rezeptoren könnten Vektoren spezifisch auf bestimmte Zelltypen umgelenkt werden. Dadurch könnte die Effektivität des Vektors im Zielgewebe erhöht und gleichzeitig gesundes Gewebe verschont werden. &lt;br&gt;In der vorliegenden Arbeit wird die Etablierung, Charakterisierung und erste Anwendung einer neuen Methode zur Selektion zellspezifisch bindender Gentherapievektoren dargelegt. 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Ergebnis dieser Optimierungen war eine <br>AAV-Peptidbank mit circa 108 einzigartig vorkommenden Peptidklonen, aus der in Selektionsversuchen AAV-Klone bzw. mutierte Capside isoliert werden können, die auf Grund ihres eingefügten, randomisierten Peptids die Fähigkeit besitzen an einen auf der Oberfläche exprimierten Rezeptor zu binden und zu internalisieren. <br>In Selektionsexperimenten auf vier verschiedenen Leukämiezelllinien konnten über drei Selektionsrunden verschiedene AAV-Peptidklone der Peptidbank angereichert werden, die gemeinsame Sequenzmuster (Motive) teilten. Da die Selektion bei dieser Methode im Capsidprotein-Kontext potentieller Gentherapievektoren durchgeführt wird, weist sie gegenüber anderen bislang angewandten Methoden des Vektortargetings entscheidende Vorteile auf und hat ein großes Anwendungspotential in der Biotechnologie und Medizin.","The improvement of efficacy and specificity of currently available gene therapy vectors is mandatory for the sucessful use of gene therapy in vivo. Targeting viral vectors to cell type specific receptors could restrict their tropism and therefore redirect them to the cell types of interest. This would increase their effectivity in the targeted tissue and decrease the uninteded transduction of healthy tissue. <br>Here, we present the establishment, characterization and first use of a novel method of selection of cell type specifically binding gene therapy vectors. This targeting method is based on adeno-associated viruses (AAV) presenting peptide ligands on their capsid surface. Such peptide ligands are inserted in the region of the AAV capsid protein that is involved in the binding of the virus to its natural receptor heparan sulfate proteoglycane (HSPG). This both abrogates the binding to HSPG and potentially mediates a redirection of AAV towards alternative, more cell type specifically expressed receptors. Aim of this work was the production of a collection of AAV in which each virus displays a unique oligopeptide with random amino acid sequence on its surface. Such AAV collections were termed random AAV display peptide libraries. <br>For the production of a random AAV peptide library a three step system (random plasmid library, transfer shuttles, random peptide libraray) was developed. This approach was used to ensure that random oligopeptides displayed on the capsid surface are exclusively the product of the DNA sequence of the AAV genome packged in the respective capsid. To produce a random peptide library with a diversity (number of different, unique capsid mutants) that is large enough to perform selection experiments, several methodological optimization steps were performed. As a result, we were able to achieve random plasmid libraries with a diversity of 108 unique clones. Due to the inserted random peptide each clone of a random peptide library has the potential ability to bind a unique receptor and internalize into a potential target cell. Upon selection, such binding clones can be isolated from a library by incubation of the cell type of interest. <br>In proof of principle selection experiments on four leukemic cell lines, a variety of AAV library clones sharing common sequence motifs could be enriched showing that the library system is functional. Because the selection is performed in the capsid protein context of potentially applicable gene therapy vectors this method has substantial advantages over other previously used methods of vector targeting and may therefore have a broad range of applications in biotechnology and medicine."]},{"key":"dc:format.medium","label":"Dc Format Medium","values":["application/pdf"]},{"key":"dc:title","label":"Title","values":["Design, Herstellungsoptimierung, Charakterisierung und Anwendung einer randomisierten, auf Adeno-assoziierten Viren exprimierten Peptidbank","Design, methodological optimization, characterization and first use of a random display peptide library based on adeno-associated viruses"]}]}],"canonical_facts":{"dc:contributor":["Kaul, Felix"],"dc:creator":["Kaul, Felix"],"dc:description.abstract":["Eine Verbesserung der Effizienz und Spezifität der bisher verfügbaren Gentherapievektoren ist eine notwendige Voraussetzung für den Einsatz und Erfolg der Gentherapie. 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Ziel dieser Arbeit war die Herstellung einer \"AAV-Kollektion\", in der jedes Virus an der Oberfläche ein anderes, in der Sequenz randomisiertes Oligopeptid trägt, eine randomisierte AAV-Peptidbank. <br>Zur Herstellung dieser randomisierten Peptidbank wurde ein 3-Schritt-System (randomisierte Plasmidbank, Transfershuttles, randomisierte Peptidbank) angewandt, welches ermöglichte, dass die auf der Capsidoberfläche präsentierten, randomisierten Oligopeptide auch von dem verpackten Virusgenom codiert werden. Um auf diese Weise eine Peptidbank mit einer für Selektionsversuche ausreichenden Diversität (Zahl verschiedener, einzigartig vorkommender Capsidmutanten) herzustellen, mussten zahlreiche Optimierungen der einzelnen Herstellungsschritte vorgenommen werden. Ergebnis dieser Optimierungen war eine <br>AAV-Peptidbank mit circa 108 einzigartig vorkommenden Peptidklonen, aus der in Selektionsversuchen AAV-Klone bzw. mutierte Capside isoliert werden können, die auf Grund ihres eingefügten, randomisierten Peptids die Fähigkeit besitzen an einen auf der Oberfläche exprimierten Rezeptor zu binden und zu internalisieren. <br>In Selektionsexperimenten auf vier verschiedenen Leukämiezelllinien konnten über drei Selektionsrunden verschiedene AAV-Peptidklone der Peptidbank angereichert werden, die gemeinsame Sequenzmuster (Motive) teilten. Da die Selektion bei dieser Methode im Capsidprotein-Kontext potentieller Gentherapievektoren durchgeführt wird, weist sie gegenüber anderen bislang angewandten Methoden des Vektortargetings entscheidende Vorteile auf und hat ein großes Anwendungspotential in der Biotechnologie und Medizin.","The improvement of efficacy and specificity of currently available gene therapy vectors is mandatory for the sucessful use of gene therapy in vivo. Targeting viral vectors to cell type specific receptors could restrict their tropism and therefore redirect them to the cell types of interest. This would increase their effectivity in the targeted tissue and decrease the uninteded transduction of healthy tissue. <br>Here, we present the establishment, characterization and first use of a novel method of selection of cell type specifically binding gene therapy vectors. This targeting method is based on adeno-associated viruses (AAV) presenting peptide ligands on their capsid surface. Such peptide ligands are inserted in the region of the AAV capsid protein that is involved in the binding of the virus to its natural receptor heparan sulfate proteoglycane (HSPG). This both abrogates the binding to HSPG and potentially mediates a redirection of AAV towards alternative, more cell type specifically expressed receptors. Aim of this work was the production of a collection of AAV in which each virus displays a unique oligopeptide with random amino acid sequence on its surface. Such AAV collections were termed random AAV display peptide libraries. <br>For the production of a random AAV peptide library a three step system (random plasmid library, transfer shuttles, random peptide libraray) was developed. This approach was used to ensure that random oligopeptides displayed on the capsid surface are exclusively the product of the DNA sequence of the AAV genome packged in the respective capsid. To produce a random peptide library with a diversity (number of different, unique capsid mutants) that is large enough to perform selection experiments, several methodological optimization steps were performed. As a result, we were able to achieve random plasmid libraries with a diversity of 108 unique clones. Due to the inserted random peptide each clone of a random peptide library has the potential ability to bind a unique receptor and internalize into a potential target cell. Upon selection, such binding clones can be isolated from a library by incubation of the cell type of interest. <br>In proof of principle selection experiments on four leukemic cell lines, a variety of AAV library clones sharing common sequence motifs could be enriched showing that the library system is functional. 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