Development of Surface Plasmon Resonance and Top-Down Mass Spectrometry Approaches to Monitor the Conformational Properties of Amyloidogenic Peptides and Their Enzymatic Cleavage: a Specific Application to Uncover the Mechanisms of Digestion of Branched Ubiquitin-Tau Proteoforms by the Human 20S Proteasome [Sviluppo di approcci di risonanza plasmonica di superficie e spettrometria di massa top-down per monitorare le proprietà conformazionali dei peptidi amiloidogenici e la loro digestione enzimatica: un'applicazione specifica per scoprire i meccanismi di digestione delle proteoforme ramificate di ubiquitina-tau da parte del proteasoma umano 20S]

L'insorgenza e la progressione della neurodegenerazione coinvolgono una rete diversificata di processi e componenti, come il ripiegamento, la selezione, il traffico e il turnover delle proteine, il sistema immunitario, la neuroinfiammazione e i tratti genetici. Un comune segno distintivo istologico della neurodegenerazione è l'accumulo di peptidi o proteine aggregate nell'ambiente intracellulare e/o extracellulare dopo la perdita della loro conformazione fisiologica. Per questo motivo, i processi neurodegenerativi sono spesso definiti malattie conformazionali. Pertanto, monitorare la conformazione adottata in soluzione dei peptidi e delle proteine coinvolti nei processi neurodegenerativi e indagare la loro suscettibilità alla digestione proteolitica è fondamentale per comprendere i meccanismi fisico-chimici della loro aggregazione ed esplorare strategie per la loro possibile eliminazione in vivo. A questo proposito, la risonanza plasmonica di superficie (SPR) è stata qui impiegata per determinare con precisione i coefficienti di diffusione di varie molecole, tra cui ioni inorganici, piccoli composti organici e proteine. La precisione e l'efficienza dell'SPR per la caratterizzazione della diffusione molecolare si sono dimostrate essenziali per monitorare il cambiamento conformazionale delle biomolecole in soluzione. Questo lavoro preliminare è stato quindi fondamentale per immaginare l'applicazione di questo approccio a macromolecole con comprovata rilevanza per la neurodegenerazione, come il dominio a quattro ripetizioni (4RD) della tau (gene MAPT). La tau è una proteina citoscheletrica nota per subire cambiamenti conformazionali che ne promuovono l'aggregazione in diverse regioni neuroanatomiche del cervello durante l'insorgenza delle "tauopatie". L'approccio SPR si è rivelato efficace per monitorare l'aggregazione precoce della 4RD-tau in vitro attraverso la determinazione della variazione del suo coefficiente di diffusione in un piccolo intervallo di tempo (3 ore), scoprendo potenziali correlazioni con la sua conformazione e lo stato di oligomerizzazione. Poiché le proprietà patologiche della tau in vivo sono fortemente influenzate da fattori quali le modifiche post-traduzionali, tra cui la fosforilazione e l'ubiquitinazione, il ruolo strutturale e funzionale dell'ubiquitinazione sito-specifica della tau 4RD è stato qui ulteriormente esplorato. A questo proposito, proteoforme mono-ubiquitinate sito-specifiche (K) della tau 4RD sono state recentemente sintetizzate mediante reazioni enzimatiche e semi-sintetiche (chimica di accoppiamento disolfuro, proteoforme Ub-S-S), vale a dire: K18 (non-Ub); Ub-K18 (Ub installato da CHIP E3-ligasi in diversi siti K); Ub-S-S-254; Ub-S-S-311; Ub-S-S-353. Per valutare se la posizione di Ub lungo la molecola influenzi la suscettibilità della proteina alla scissione proteasomale, singole preparazioni di 4RD-tau sono state somministrate al Proteasoma 20S umano (h20S). Sono stati quindi applicati esperimenti di SDS-PAGE e spettrometria di massa top-down (MS) per studiare il modello di degradazione delle proteoforme tau e per monitorare il rilascio dei frammenti di digestione. Lo sviluppo di un nuovo software chiamato SpectraSage è stato di fondamentale importanza per l'analisi, l'identificazione e la quantificazione, senza ambiguità, dei frammenti di digestione in modalità MS1. L'applicazione di software di proteomica canonica (Proteome Discoverer per Ub enzimatica) e SpectraSage (per proteoforme di Ub sito-specifiche) ha permesso di rilevare che: a) l'introduzione di Ub tramite reazione enzimatica rende la 4RD-tau suscettibile alla digestione mediata da h20S, poiché la proteina 4RD non-Ub è resistente e Ub viene scissa insieme al substrato proteico; b) h20S mostra preferenze per proteoforme con Ub installata in uno dei due termini (rispettivamente posizioni -254 e -353) mentre -311 non è un buon substrato; c) Ub viene scissa insieme al substrato ma con preferenze aminoacidiche diverse da quelle di 4RD-tau. Pertanto, questo studio supporta l'ipotesi che h20S possa degradare le proteine mono-Ub in vitro, introducendo ulteriori meccanismi biochimici che regolano questo fenomeno insieme alle preferenze catalitiche dell'h20S.

Grantor dc:publisher

Università degli studi di Catania

Year dc:date

2025

Author dc:creator

• ZINGALE, Gabriele Antonio

Contributors dc:contributor

• GRASSO, GIUSEPPE
• SPOTO, Giuseppe

• Mass Spectrometry
• Surface Plasmon Resonance
• Proteomic
• Liquid Chromatography
• Protein
• Peptide
• Diffusion Coefficient
• Enzymatic Digestion
• Branched Protein
• Ubiquitin Proteasome System
• Spettrometria di Massa
• Risonanza Plasmonica di Superficie
• Proteomica
• Cromatografia Liquida
• Proteine
• Peptidi
• Coefficiente di Diffusione
• Digestione Enzimatica
• Proteine Ramificate
• Sistema Ubquitina Proteasoma

Statement dc:rights

• info:eu-repo/semantics/openAccess
• license:NON PUBBLICO - Accesso privato/ristretto
• license uri:iris.PRI01

Language dc:language

eng

Handle dc:identifier

https://hdl.handle.net/20.500.11769/685318

OAI identifier oai:identifier

oai:www.iris.unict.it:20.500.11769/685318