Development of Surface Plasmon Resonance and Top-Down Mass Spectrometry Approaches to Monitor the Conformational Properties of Amyloidogenic Peptides and Their Enzymatic Cleavage: a Specific Application to Uncover the Mechanisms of Digestion of Branched Ubiquitin-Tau Proteoforms by the Human 20S Proteasome [Sviluppo di approcci di risonanza plasmonica di superficie e spettrometria di massa top-down per monitorare le proprietà conformazionali dei peptidi amiloidogenici e la loro digestione enzimatica: un'applicazione specifica per scoprire i meccanismi di digestione delle proteoforme ramificate di ubiquitina-tau da parte del proteasoma umano 20S]
L'insorgenza e la progressione della neurodegenerazione coinvolgono una rete diversificata di processi e componenti, come il ripiegamento, la selezione, il traffico e il turnover delle proteine, il sistema immunitario, la neuroinfiammazione e i tratti genetici. Un comune segno distintivo istologico della neurodegenerazione è l'accumulo di peptidi o proteine aggregate nell'ambiente intracellulare e/o extracellulare dopo la perdita della loro conformazione fisiologica. Per questo motivo, i processi neurodegenerativi sono spesso definiti malattie conformazionali. Pertanto, monitorare la conformazione adottata in soluzione dei peptidi e delle proteine coinvolti nei processi neurodegenerativi e indagare la loro suscettibilità alla digestione proteolitica è fondamentale per comprendere i meccanismi fisico-chimici della loro aggregazione ed esplorare strategie per la loro possibile eliminazione in vivo. A questo proposito, la risonanza plasmonica di superficie (SPR) è stata qui impiegata per determinare con precisione i coefficienti di diffusione di varie molecole, tra cui ioni inorganici, piccoli composti organici e proteine. La precisione e l'efficienza dell'SPR per la caratterizzazione della diffusione molecolare si sono dimostrate essenziali per monitorare il cambiamento conformazionale delle biomolecole in soluzione. Questo lavoro preliminare è stato quindi fondamentale per immaginare l'applicazione di questo approccio a macromolecole con comprovata rilevanza per la neurodegenerazione, come il dominio a quattro ripetizioni (4RD) della tau (gene MAPT). La tau è una proteina citoscheletrica nota per subire cambiamenti conformazionali che ne promuovono l'aggregazione in diverse regioni neuroanatomiche del cervello durante l'insorgenza delle "tauopatie". L'approccio SPR si è rivelato efficace per monitorare l'aggregazione precoce della 4RD-tau in vitro attraverso la determinazione della variazione del suo coefficiente di diffusione in un piccolo intervallo di tempo (3 ore), scoprendo potenziali correlazioni con la sua conformazione e lo stato di oligomerizzazione. Poiché le proprietà patologiche della tau in vivo sono fortemente influenzate da fattori quali le modifiche post-traduzionali, tra cui la fosforilazione e l'ubiquitinazione, il ruolo strutturale e funzionale dell'ubiquitinazione sito-specifica della tau 4RD è stato qui ulteriormente esplorato. A questo proposito, proteoforme mono-ubiquitinate sito-specifiche (K) della tau 4RD sono state recentemente sintetizzate mediante reazioni enzimatiche e semi-sintetiche (chimica di accoppiamento disolfuro, proteoforme Ub-S-S), vale a dire: K18 (non-Ub); Ub-K18 (Ub installato da CHIP E3-ligasi in diversi siti K); Ub-S-S-254; Ub-S-S-311; Ub-S-S-353. Per valutare se la posizione di Ub lungo la molecola influenzi la suscettibilità della proteina alla scissione proteasomale, singole preparazioni di 4RD-tau sono state somministrate al Proteasoma 20S umano (h20S). Sono stati quindi applicati esperimenti di SDS-PAGE e spettrometria di massa top-down (MS) per studiare il modello di degradazione delle proteoforme tau e per monitorare il rilascio dei frammenti di digestione. Lo sviluppo di un nuovo software chiamato SpectraSage è stato di fondamentale importanza per l'analisi, l'identificazione e la quantificazione, senza ambiguità, dei frammenti di digestione in modalità MS1. L'applicazione di software di proteomica canonica (Proteome Discoverer per Ub enzimatica) e SpectraSage (per proteoforme di Ub sito-specifiche) ha permesso di rilevare che: a) l'introduzione di Ub tramite reazione enzimatica rende la 4RD-tau suscettibile alla digestione mediata da h20S, poiché la proteina 4RD non-Ub è resistente e Ub viene scissa insieme al substrato proteico; b) h20S mostra preferenze per proteoforme con Ub installata in uno dei due termini (rispettivamente posizioni -254 e -353) mentre -311 non è un buon substrato; c) Ub viene scissa insieme al substrato ma con preferenze aminoacidiche diverse da quelle di 4RD-tau. Pertanto, questo studio supporta l'ipotesi che h20S possa degradare le proteine mono-Ub in vitro, introducendo ulteriori meccanismi biochimici che regolano questo fenomeno insieme alle preferenze catalitiche dell'h20S.
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