Characterizing the RanGAP1-RanBP2 complex in mitosis

Der RanGAP1-RanBP2 Komplex stellt ein faszinierendes makromolekulares Gebilde dar, welches mindestens zwei enzymatische Aktivitäten umfasst. Zum einen beinhaltet der Komplex die GTP-Hydrolyse aktivierende Funktion, die RanGAP1 zusammen mit RanBP2 ausübt, zum anderen besitzt RanBP2 zusammen mit Ubc9 Sumo-konjugierende Aktivität. Gemeinsam sind diese Proteine essentielle Regulatoren des nukleo-zytoplasmatischen Transportes in Interphasezellen, und spielen des Weiteren eine wichtige, bislang jedoch kaum verstandene Rolle für die Funktion der Kinetochore in Mitose.Um den RanGAP1-RanBP2 Komplex spezifisch in mitotischen Zellen näher zu untersuchen, habe ich spezifisch in Mitose nach Interaktionspartnern gesucht. Dies führte zur Identifikation des Kernexportrezeptors Crm1 und der GTPase Ran als stabile Komponenten in einem Komplex mit RanGAP1, RanBP2 und Ubc9 in mitotischen Zellen. Zusätzlich schien dieser Komplex zahlreiche weitere Proteine in substöchiometrischen Mengen zu enthalten. Diese könnten beispielsweise NES-enthaltende Interaktionspartner von Crm1 und/oder Substrate für RanBP2-abhängige Sumoylierung sein. Da bisher RanBP2-abhängige Sumo-Substrate weitgehend unbekannt sind, habe ich eine Strategie entwickelt, um sumoylierte Proteine aus immungereinigtem RanGAP1-RanBP2 Komplex anzureichern. Dies ermöglichte die massenspektrometrische Identifizierung von ungefähr 90 potentiellen Sumo-Substraten, die spezifisch in mitotischen RanGAP1 Komplexen angereichert waren; 6 dieser Substrate wurden zur weiteren Charakterisierung ausgewä! hlt. Alle Kandidaten assoziierten mit mitotischen RanGAP1 Komplexen (Topo II alpha, TACC2, CKAP-5, Plk1, USP7, PIAS1). Die meisten davon konnten entweder in vitro mit rekombinanten Faktoren (TACC2, Plk1) oder als endogene Proteine, die mit mitotischem RanGAP1-RanBP2 Komplex als Quelle der Sumo E3 Ligase-Aktivität assoziiert waren (TopoII alpha, Plk1, USP7), sumoyliert werden. Auffällig war die Co-Reinigung der Sumo E3 Ligase PIAS1 mit RanGAP1 aus mitotischen Zellen; diese wurde ebenfalls effizient sumoyliert. Weitere Analysen deuteten darauf hin, dass RanGAP1 in einem Komplex mit PIAS1 enthalten ist, der sich vom RanGAP1-RanBP2 Komplex unterscheidet.In einem Nebenprojekt konnte ich zeigen, dass das Sumo-konjugierende Enzym Ubc9 in Zellen an Lysin 14 sumoyliert werden kann. Dieser Befund war wichtig, um eine biochemische Studie von Knipscheer et al. zu ergänzen, die einen neuen Mechanismus der Selektion von Sumo-Substraten identifizierte; diese Ergebnisse flossen in die Veröffentlichung Knipscheer, Flotho, Klug et al. (2008) Mol Cell ein.

Author dc:creator

• Flotho, Annette

Contributors dc:contributor

• Melchior, Frauke Prof. Dr.
• Ficner, Ralf Prof. Dr.

• 570 Biowissenschaften, Biologie
• Biologie
• RanGAP1
• RanBP2
• Ubc9
• Crm1
• Ran
• Sumo
• 42.13
• 42.15
• 35.70
• WF 200: Molekularbiologie
• WHF 500: Zellteilung {Cytologie}

Licence

• https://webdoc.sub.gwdg.de/diss/copyr_diss.html

Language dc:language

eng

Identifier

https://dx.doi.org/10.53846/goediss-328
urn:nbn:de:gbv:7-webdoc-2060-7
webdoc-2060
661849538

OAI identifier oai:identifier

oai:ediss.uni-goettingen.de:11858/00-1735-0000-0006-AD39-C