Functional and structural investigation of spliceosomal snRNPs

In die Expression der meisten eukaryontischen Protein-kodierenden Gene sind Prozessierungsschritte von Vorläufermolekülen der Boten-RNAs (engl. pre-mRNAs), wie z. B. das Spleißen von pre-mRNAs, involviert. Das Spleißen von pre-mRNAs wird von einem aus mehreren Untereinheiten bestehenden Protein-RNA-Enzym, dem Spleißosom, katalysiert. Das Spleißosom lagert sich schrittweise an hochkonservierten Sequenzen des pre-mRNA-Substrats zusammen und wird aus mehreren kleinen Ribonukleoproteinpartikeln (engl. snRNPs) und nicht-snRNP-Proteinen gebildet. In Hefen und Menschen ist das U2 snRNP eine essentielle Komponente beim Spleißen von pre-mRNA-Molekülen, wobei es während der Bildung des Spleißosoms an der Erkennung bzw. Auswahl der Verzweigungsstellen (engl. branch sites) der pre-mRNA-Moleküle und auch während der Katalyse der Spleißreaktion eine Rolle spielt. Ein 12S U2 snRNP besteht aus der U2 snRNA, welche im Komplex mit zwei U2 snRNP-spezifischen Proteinen, U2-A und U2-B , vorliegt, und einem Satz aus sieben so genannten Sm-Proteinen. In katalytisch-aktiven 17S U2 snRNPs sind zusätzlich zwei heteromere Spleißfaktoren zu finden, SF3a und SF3b, welche aus drei (SF3a120, SF3a66 und SF3a60) bzw. sieben (SF3b155, SF3b145, SF3b130, SF3b49, SF3b14a/p14, SF3b14b und SF3b10) Proteinen bestehen. In der Hefe Saccaromyces cerevisiae wurde gezeigt, dass neben den Hefe-Orthologen Hsh155p, Rse1p, Cus1p, Hsh49p, Rds3p und Rcp10p/Ysf3p mindestens zwei weitere Proteine, Bud31p und Snu17p/Ist3p, in SF3b Partikeln präsent sind. Außerdem ist Snu17p auch in einem Komplex mit den Proteinen Pml1p und Bud13p enthalten. Diese drei Proteine formen den pre-mRNA retention and splicing (RES) Komplex, dessen Aktivität dem Austreten von ungespleißten pre-mRNAs aus dem Nukleus entgegenwirkt und welcher für die Aktivierung des Spleißens eines Teils von Mer1p-abhängigen Genen benötigt wird. Ein homologer Komplex ist in humanen präkatalytischen, aktivierten und Schritt 1-Spleißosomen zu finden. Strukturelle Analysen mit Hilfe der Elektronenmikroskopie, Kernresonanzspektroskopie und Röntgenkristallographie lieferten wichtige Einblicke in die Strukturen von 17S U2 snRNP Subkomplexen und Proteinen, allerdings liegen noch keine Modelle von 12S U2 snRNPs, Partikeln des SF3b, sowie des RES Komplexes mit atomarer Auflösung vor. Um atomar aufgelöste Modelle von humanen 12S U2 snRNPs und SF3b Partikeln zu erhalten, begann ich, diese Partikel für Röntgenstrukuranalysen zu produzieren. Ich konnte Reinigungsprotokolle für native, aus HeLa-Zellkultur isolierte 12S U2 snRNPs und SF3b Partikel für kristallographische Analysen optimieren. Da keine Kristalle aus nativen 12S U2 snRNPs gezüchtet werden konnten, wurden vermutlich unstrukturierte Bereiche der U2 snRNA, der Sm-Proteine Sm B/B und der Proteine U2-A und U2-B mit Hilfe eines DNA-gelenkten RNaseH Schnitts, sowie limitierter Proteolyse, erfolgreich entfernt. U2 snRNP Partikel mit verkürzter snRNA oder mit verkürzter snRNA und verkürzten Proteinen Sm B/B wurden der Kristallisation bei einer Konzentration von 10 mg/ml zugeführt. U2 snRNPs mit verkürzter snRNA und verkürzten Proteinen Sm-B/B , U2-A und U2-B konnten in analytischem Maßstab gereinigt werden. Die etablierten Reinigungsprotokolle erlauben eine zukünftige präparative Produktion der Partikel. SF3b Partikel wurden gereinigt und auf Kristallwachstum bei Konzentrationen von mindestens 9 mg/ml überprüft. Während der Präparation von SF3b Partikeln konnte ein bis dato unbekannter Komplex isoliert und charakterisiert werden. Dieser Komplex besteht aus mindestens vier Komponenten, einer DEAD-box Helikase DDX1, sowie den Proteinen HSPC117, Family with sequence similarity 98/member B und CGI-99. Die Assoziation dieses Komplexes mit SF3b Partikeln wird diskutiert. Um das Wissen über das Protein Snu17p und seiner Interaktionspartner zu erweitern, beschäftigte ich mich ferner mit der Charakterisierung des RES Komplexes aus der Bäckerhefe. Hierbei verwendete ich verschiedene, biophysikalische und biochemische Methoden, um die Architektur dieses Komplexes aufzuklären. GST pull-down Experimente und Größenausschlußchromatographie zeigten, dass Snu17p die zentrale Plattform des Komplexes darstellt, wohingegen die zwei anderen Komponenten, Pml1p und Bud13p, nicht miteinander interagieren. Fluorimetrische Struktursondierungen zeigten, dass das gesamte Bud13p und der N-terminale Bereich des Pml1p nativ ungefaltet in isolierter Form vorliegen. Mutationsanalysen und Tryptophanfluoreszenzmessungen bestätigten, dass ein konserviertes Tryptophan-haltiges Motiv im C-terminalen Bereich des Bud13p mit dem Kernbereich des RNA-Bindemotivs des Snu17p interagiert. Ferner zeigten diese Experimente, dass eine C-terminale Extension des RNA-Bindemotivs des Snu 17p für die Binding eines N-terminalen Peptids des Pml1p notwendig ist. Über isothermale Titrationskalorimetrie konnten 1:1 Stöchiometrien, große negative Bindungsentropien und Dissoziationskonstanten im niedrigen nanomolaren, bzw. mikromolaren Bereich für die Snu17p-Bud13p und die Snu17p-Pml1p Interaktionen gezeigt werden. Durch peptide-scanning Experimente konnten die Interaktionsregionen zu Snu17p in Bud13p und Pml1p auf die Aminosäure genau definiert werden. Vorläufige Ergebnisse aus Untersuchungen mit Hilfe der NMR Spektroskopie und limitierter Proteolyse zeigten, dass Snu17p als molten globule-ähnliche Struktur vorliegt und sich durch die Bindung von mindestens einem Interaktionspartner faltet. Folglich interagiert das nicht-kanonische RNA-Bindemotiv des Snu17p mit kurzen, intrinsisch ungefalteten Peptid-Epitopen verschiedener Proteine und agiert dabei als Plattform, um funktionale Module, wie eine forkhead-assoziierte (FHA) Domäne des Pml1p oder ein konserviertes poly-Lysin-Motiv des Bud13p, zu präsentieren. Die Kristallstrukturen des gesamten Pml1p und eines N-terminal verkürzten Pml1p konnten gelöst werden und bestätigten das Vorhandensein einer FHA-Domäne in der C-terminalen Region. FHA-Domänen sind kleine Proteinmodule, welche phosphorylierte Epitope anderer Proteine binden können. Die ersten 50 Reste des Pml1p sind ungeordnet und für die Bindung zum Snu17p verantwortlich. Eine nicht-kanonische N-terminale Verlängerung des Moduls läuft entlang eines -Faltblattes und stabilisiert dadurch die FHA-Domäne des Pml1p. Über strukturbasierte Sequenzvergleiche konnte eine ähnliche Verlängerung im humanen Protein NIPP1 gefunden werden. Interessanterweise wurde NIPP1 erst kürzlich als Spleißosom-assoziiertes Protein beschrieben. Im Kristall des voll-längen Pml1p konnte ein Sulfat-Ion gefunden werden, welches durch Reste der putativen Phosphopeptid-bindenden Schleifenstrukturen koordiniert wird. Kristalle des verkürzten Pml1p Proteins wiesen kein Sulfat-Ion auf, zeigten aber eine nahezu gleiche Struktur des geordneten Bereichs des Pml1p. Eine lange Schleifenstruktur, welche der Phosphopeptid-bindenden Region angrenzt, ist in beiden Strukturen ungeordnet und könnte für die Ligand-Spezifität eine Rolle spielen. Wahrscheinlich erkennt Pml1p phosphorylierte Aminosäuren in Liganden über ein Schlüssel-Schloß-Prinzip, wohingegen die Spezifität womöglich auf einer induced-fit-Interaktion beruht. Die vorgelegten Resultate lassen vermuten, dass Pml1p als Phosphorylierungssensor durch Snu17p zum Spleißosom rekrutiert wird. Basierend auf den in dieser Arbeit präsentierten Resultaten wird ein Modell der molekularen Architektur des RES Komplexes vorgestellt.

Author dc:creator

• Trowitzsch, Simon

Contributors dc:contributor

• Wahl, Markus Prof. Dr.
• Ficner, Ralf Prof. Dr.
• Einsle, Oliver Prof. Dr.

• 570 Biowissenschaften, Biologie
• Biologie
• Röntgenkristallographie
• snRNP
• Spleißen
• intrinsisch ungefaltete Domäne
• forkhead-assoziierte Domäne
• Proteinphosphorylierung
• RES Komplex
• X-Ray Crystallography
• splicing
• intrinsically unstructured domain
• forkhead-associated domain
• pre-mRNA retention and splicing
• protein phosphorylation
• RES complex
• 42.13
• WF 000: Molekularbiologie, Gentechnologie

Licence

• https://creativecommons.org/licenses/by-nd/2.0/de/

Language dc:language

eng

Identifier

https://dx.doi.org/10.53846/goediss-311
urn:nbn:de:gbv:7-webdoc-2004-6
webdoc-2004
614256887

OAI identifier oai:identifier

oai:ediss.uni-goettingen.de:11858/00-1735-0000-0006-AD28-3