Biophysical Characterization of SNARE Complex Disassembly Catalyzed by NSF and alphaSNAP

Fuer die Fusion intrazellulaerer biologischer Membranen sind Vertreter der konservierten Familie der SNARE-Proteine von essentieller Bedeutung. Man vermutet, dass gerichtete Komplexbildung zwischen SNAREs auf gegenueberliegenden Membranen dazu fuehrt, dass die zu fusionierenden Mebranen in raeumliche Naehe gezogen werden und schliesslich verschmelzen. SNARE-Komplexe bilden sich spontan, wenn die einzelnen SNARE-Komponenten in Loesung vermengt werden und sind aeusserst stabil. Es muss daher Energie aufgewendet werden, um die SNARE-Komplexe nach der Membranfusion wieder in ihre Einzelteile zu dissoziieren um damit die einzelnen SNAREs fuer weitere Fusionsereignisse zur Verfuegung zu stellen. Deshalb wird die Dissoziierung der SNARE-Komplexe durch ein Enzym, die AAA ATPase NSF sowie ihren Kofaktor SNAP vermittelt. Dazu binden vermutlich drei SNAP-Molekuele einen SNARE-Komplex und bilden so ein Podest, das als Angriffsstelle fuer das hexamere, ringfoermige NSF dient.Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die molekularen Grundlagen der SNARE-Komplex- Dissoziierung inklusive verschiedener SNAP-Isoformen und moeglicher regulatorischer Faktoren, sowie den Grad der funktionellen Koservierung zu untersuchen. Hierzu wurden zwei fluoreszenzbasierte in vitro Methoden (FRET und Fluoreszenz- Anisotropy) zur direkten Messung des SNARE-Komplex Dissoziation durch NSF und alphaSNAP etabliert. Waehrend der Charakterisierung der Reaktion zeigte sich, dass das verwendete rekombinante alphaSNAP deutlich effizienter auf einer Plasmamembranpraeparation "ex vivo" als in den in vitro FRET- und Anisotropie-Ansaetzen agierte. Es reichte aus, die rekombinanten SNARE-Komplexe vor der Reaktion in Liposomen zu inkorporieren, um die beobachtete Diskrepanz zwischen der ex vivo- und der in vitro-Praeparation zu eliminieren. Dieses deutet darauf hin, dass Lipidmembranen die Faehigkeit von alphaSNAP, im Verbund mit NSF SNARE-Komplexe zu dissoziieren, erhoehen.Weiter konnte ich den Unterschied zwischen der Effizienz des alphaSNAPs in Loesung und auf Liposomen aufheben, indem ich eine N-terminale Deletion des alphaSNAP-Proteins vornahm. Dieser Befund laesst darauf schliessen, dass die N-terminale Interaktion von alphaSNAP mit der Membran die Effektivitaet von alphaSNAP waehrend der SNARE-Komplex-Dissoziation steigert. Zusaetzlich zu dem membrangebundenen SNARE-Komplex scheint die Membran selbst demnach als zweiter, kooperativer SNAP-Bindungspartner zu fungieren. Zudem konnte ich zeigen, dass die Verstaerkung der SNAP-Effizienz in Gegenwart von Membranen auch fuer die Isoform betaSNAP und das Hefe-Homolog Sec17 konserviert ist. Ausserdem habe ich mithilfe verschiedener Mutanten und Inhibitoren moegliche regulatorische Angriffspunkte charakterisiert. Ein Antikoerper gegen die N-terminal Domaene von NSF, der auch im Rahmen dieser Arbeit hergestellt wurde, vermochte die Dissoziationsreaktion komplett zu blockieren und koennte zukuenftig fuer in vivo- Experimente eingesetzt werden. Drei Antikoerper gegen den SNARE-Komplex hemmten die Dissoziationsreaktion teilweise, aber eine komplette Inhibition gelang nur, wenn zwei Antikoerper gemeinsam eingesetzt wurden, einer gegen den N-Terminus und der andere gegen den C-Terminus von alphaSNAP. Analog dazu blockierten SNARE-Komplex- Mutanten die Dissoziationsreaktion nur, wenn zwei entfernte Positionen mutiert worden waren. All dies laesst darauf schliessen, dass die Reaktion sehr robust ist.Das SNARE-Komplex-bindende Protein Complexin1 inhibierte die Reaktion in Abhaengigkeit von der alphaSNAP-Konzentration. Die Ergebnisse zeigen, dass Complexin und alphaSNAP unter in vitro-Bedingungen miteinander um die SNARE-Komplex- Bindung konkurrieren. Der inhibitorische Effekt von Complexin war in Loesung staerker als auf Liposomen, sodass davon ausgegangen werden kann, dass die Affinitaet von Complexin zum SNARE-Komplex sich in Gegenwart von Membranen nicht im selben Ausmass steigert wie die von alphaSNAP. Schliesslich konnte ich zeigte, dass beide Protein-Schnittstellen zwischen Substrat, Adaptor und Enzym zwischen Hefen und Saeugern stark genug konserviert sind um den Austausch einzelner Komponenten zu ermoeglichen, ohne dass die Reaktion zum Erliegen kommt. Dabei fuehrt der Austausch des Adaptors zu einem weitaus staerkeren Defekt als der Austausch des Enzyms oder des Komplexes. Offenbar wird die Reaktion demnach nur dann schwer gestoert, wenn sich an beiden Schnittstellen Proteine aus verschiedenen Organismen treffen.

Author dc:creator

• Winter, Ulrike

Contributors dc:contributor

• Fasshauer, Dirk Prof. Dr.
• Jahn, Reinhard Prof. Dr.
• Ficner, Ralf Prof. Dr.

• 570 Biowissenschaften, Biologie
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• 42.12 Biophysik
• WC

Licence

• https://creativecommons.org/licenses/by-nd/2.0/de/

Language dc:language

eng

Identifier

https://dx.doi.org/10.53846/goediss-282
urn:nbn:de:gbv:7-webdoc-1891-1
webdoc-1891
596070306

OAI identifier oai:identifier

oai:ediss.uni-goettingen.de:11858/00-1735-0000-0006-AD0B-5