Expression, Charakterisierung und Kristallisation der spleißosomalen Proteine SMNrp, U4/U6-60k und U4/U6-90k

Der U4/U6-20k/60k/90k-Komplex, der Bestandteil des U4/U6*U5-snRNP-Komplexes ist, und SMNrp sind an der Assemblierung des humanen Spleißosoms beteiligt. Es wird vorgeschlagen, dass die Rekrutierung des U4/U6*U5-snRNP-Komplexes zum prä-Spleißosom durch die Bindung des SMNrp an 90k erleichtert wird. Zur Kristallisation wurden die humanen Proteine 60k, SMNrp, 90k und die generierten 90k-Fragmente in Escherichia coli exprimiert und gereinigt.90k wurde mit Hilfe eines N-terminalen His-tags exprimiert und gereinigt. Da die Ausbeute nicht zufrieden stellend war, wurde es als MBP-Fusionsprotein produziert. Nach proteolytischer Spaltung wurde 90k bis zur Homogenität aufgereinigt. Außerdem wurden drei verkürzte Fragmente vom 90k (683 Aminosäuren) mittels PCR generiert und diese entsprechend der Anfangs- und Endposition der Aminosäuren benannt: 90k(1-174), 90k(1-426) und 90k(175-426). Diese Fragmente wurden als MBP-Fusionsproteine exprimiert, affinitätsgereinigt und proteolytisch gespalten. Mit Ausnahme des 90k(1-174) konnten 90k(1-426) und 90k(175-426) weiter gereinigt werden. 60k konnte als GST-Fusionsprotein nur unlöslich exprimiert werden und als MBP-Fusionsprotein aggregierte es jedoch unspezifisch. Ein weiteres 90k-bindendes Protein war SMNrp, das als GST-Fusionsprotein exprimiert und gereinigt wurde. Durch proteolytische Spaltung konnte es vom GST getrennt werden. Die gereinigten Proteine wurden anschließend für Bindungsstudien verwendet. Es konnten folgende Komplexe rekonstituiert werden: SMNrp::90k, SMNrp::90k(1-426), SMNrp::90k(175-426), 60k::90k, 60k::20K. Abschließend wurden die Proteine und Proteinkomplexe für Kristallisationsstudien verwendet. Es wurden ausschließlich vom MBP-60k Kristalle erhalten, die zur Strukturaufklärung nicht geeignet waren.

Author dc:creator

• Gouloudis, Christos

Contributors dc:contributor

• Ficner, Ralf Prof. Dr.
• Braus, Gerhard Prof. Dr.

• 570 Biowissenschaften, Biologie
• Biologie
• Spleißosom
• UsnRNP
• SMNrp
• U4/U6-60k
• U4/U6-90k
• Spliceosome
• 42.13
• WA 330: Chromatographie {Biologie}
• WJD 200: Gen-Expression {Biologie, Genetik}

Licence

• https://webdoc.sub.gwdg.de/diss/copyr_diss.html

Language dc:language

ger

Identifier

https://dx.doi.org/10.53846/goediss-620
urn:nbn:de:gbv:7-webdoc-641-5
webdoc-641
509292941

OAI identifier oai:identifier

oai:ediss.uni-goettingen.de:11858/00-1735-0000-0006-ABAE-5