{"id":{"repo_id":"goettingen","oai_identifier":"oai:ediss.uni-goettingen.de:11858/00-1735-0000-0006-ABAE-5"},"canonical_url":"https://search.dev.ndltd.org/etd/goettingen/oai:ediss.uni-goettingen.de:11858/00-1735-0000-0006-ABAE-5","repository":{"repo_id":"goettingen","name":"Georg-August-Universität Göttingen","base_url":"https://ediss.uni-goettingen.de/oai/request"},"display":{"title":"Expression, Charakterisierung und Kristallisation der spleißosomalen Proteine SMNrp, U4/U6-60k und U4/U6-90k","abstract":"Der U4/U6-20k/60k/90k-Komplex, der Bestandteil des U4/U6*U5-snRNP-Komplexes ist, und SMNrp sind an der Assemblierung des humanen Spleißosoms beteiligt. Es wird vorgeschlagen, dass die Rekrutierung des U4/U6*U5-snRNP-Komplexes zum prä-Spleißosom durch die Bindung des SMNrp an 90k erleichtert wird. Zur Kristallisation wurden die humanen Proteine 60k, SMNrp, 90k und die generierten 90k-Fragmente in Escherichia coli exprimiert und gereinigt.90k wurde mit Hilfe eines N-terminalen His-tags exprimiert und gereinigt. Da die Ausbeute nicht zufrieden stellend war, wurde es als MBP-Fusionsprotein produziert. Nach proteolytischer Spaltung wurde 90k bis zur Homogenität aufgereinigt. Außerdem wurden drei verkürzte Fragmente vom 90k (683 Aminosäuren) mittels PCR generiert und diese entsprechend der Anfangs- und Endposition der Aminosäuren benannt: 90k(1-174), 90k(1-426) und 90k(175-426). Diese Fragmente wurden als MBP-Fusionsproteine exprimiert, affinitätsgereinigt und proteolytisch gespalten. Mit Ausnahme des 90k(1-174) konnten 90k(1-426) und 90k(175-426) weiter gereinigt werden. 60k konnte als GST-Fusionsprotein nur unlöslich exprimiert werden und als MBP-Fusionsprotein aggregierte es jedoch unspezifisch. Ein weiteres 90k-bindendes Protein war SMNrp, das als GST-Fusionsprotein exprimiert und gereinigt wurde. Durch proteolytische Spaltung konnte es vom GST getrennt werden. Die gereinigten Proteine wurden anschließend für Bindungsstudien verwendet. Es konnten folgende Komplexe rekonstituiert werden: SMNrp::90k, SMNrp::90k(1-426), SMNrp::90k(175-426), 60k::90k, 60k::20K. Abschließend wurden die Proteine und Proteinkomplexe für Kristallisationsstudien verwendet. Es wurden ausschließlich vom MBP-60k Kristalle erhalten, die zur Strukturaufklärung nicht geeignet waren.","abstract_html":"Der U4/U6-20k/60k/90k-Komplex, der Bestandteil des U4/U6*U5-snRNP-Komplexes ist, und SMNrp sind an der Assemblierung des humanen Spleißosoms beteiligt. Es wird vorgeschlagen, dass die Rekrutierung des U4/U6*U5-snRNP-Komplexes zum prä-Spleißosom durch die Bindung des SMNrp an 90k erleichtert wird. 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It was suggested that the recruiting of the U4/U6*U5-snRNP-complex to the pre-spliceosome is supported by the binding of SMNrp to 90k. For crystallisation attempts the human proteins 60k, SMNrp, 90k and the generated 90k-fragments were expressed in Escherichia coli and purified.90k was expressed and purified via its N-terminal His-tag. Since the yield was not sufficient, it was produced as MBP-fusion protein. After proteolytic cleavage 90k was further purified. In addition three truncated 90k-fragments were generated (683 amino acids) by means of PCR and designated according to the beginning and final position of their amino acids: 90k(1-174), 90k(1-426) and 90k(175-426). These fragments were expressed as MBP-fusion proteins, purified and cleaved proteolytically. With exception of the 90k(1-174) the other two fragments 90k(1-426) and 90k(175-426) were successfully further purified. Unlike to the so far described proteins, 60k was unsoluble when expressed as GST-fusion protein and as MBP-fusion protein 60k aggregated unspecifically. An other protein which binds to 90k is SMNrp. This was expressed and purified as GST-fusion protein. It could be separated from GST by proteolytic cleavage. The purified proteins were used afterwards for binding studies. The following complexes were reconstituted: SMNrp::90k, SMNrp::90k(1-426), SMNrp::90k(175-426), 60k::90k, 60k::20K. Finally the proteins and protein comple xes were used for crystallisation attempts. Crystals were obtained exclusively from MBP-60k. These crystals could not be used for structure determination."]},{"key":"dc:format","label":"Dc Format","values":["application/pdf"]},{"key":"dc:title","label":"Title","values":["Expression, Charakterisierung und Kristallisation der spleißosomalen Proteine SMNrp, U4/U6-60k und U4/U6-90k","Expression, characterisation and crystallisation of the spliceosomal proteins SMNrp, U4/U6-60k and U4/U6-90k"]}]}],"canonical_facts":{"dc:contributor":["Ficner, Ralf Prof. Dr.","Braus, Gerhard Prof. Dr."],"dc:creator":["Gouloudis, Christos"],"dc:date":["2012-04-16T14:56:37Z","2013-01-30T23:50:32Z","2006-01-20","2005-01-26"],"dc:description":["Der U4/U6-20k/60k/90k-Komplex, der Bestandteil des U4/U6*U5-snRNP-Komplexes ist, und SMNrp sind an der Assemblierung des humanen Spleißosoms beteiligt. Es wird vorgeschlagen, dass die Rekrutierung des U4/U6*U5-snRNP-Komplexes zum prä-Spleißosom durch die Bindung des SMNrp an 90k erleichtert wird. 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