Functional gene analysis in cultured vertebrate cells using siRNA mediated gene silencing

Die Expression von Genen kann sequenzspezifisch durch small interfering RNAs (engl. kleine interferierende RNAs, siRNAs) in einem als RNA Interferenz (RNAi) bezeichneten Prozeß herunterreguliert werden. Die Anwendung von RNAi Technologie erlaubt die systematische Analyse von Genexpression und Genfunktionen. In dieser Dissertation characterisiere ich RNAi induzierte Phänotypen verschiedener Zielgene in Zelllinien aus Säugetieren. Zudem beschreibe ich neue Aspekte des Designs von siRNAs, die Transfektion mit siRNAs mittels einer neuen Technik und befasse mich mit der Anwendung von RNAi im Zebrafisch Danio rerio.Die Anwendung von RNAi als Mittel zur Klärung von Genfunktionen beinhaltete als Zielgene die humane Endoprotease FACE1, welche indirekt mit dem Hutchinson Gilford Progeria Syndrom (HGPS) in Verbindung steht, das humane Protein Astrin, sowie Proteine der Kinetochore (scc1, smc1, smc3, securin und separase) und Kinesin verwandte Motorproteine (MCAK, TPX2, HSET, KIA0622).Die Zinkfinger Metallprotease prozessiert das Zellkernprotein prelamin A durch endoproteolytische Entfernung der carboxyterminalen 16 Aminosäuren zu reifem lamin A. Die Unterdrückung dieser proteolytischen Spaltung des prelamins A durch RNAi gegen FACE1 resultiert in der Akkumulation von nicht prozessiertem prelamin A und einem deutlichen Phänotyp, der Veränderungen der Zellkernarchitektur, einen mitotischen Arrest und apoptotischen Zelltod beinhaltet. Ähnliche Effekte sind von HGPS Patienten bekannt, in welchen die FACE1 Schnittstelle des prelamin A Proteins durch eine Punktmutation und alternatives Spleissen verlorengeht. Durch RNAi konnte ich außerdem zeigen, dass sowohl astrin als auch eine Reihe weiterer mitoseverwandter Proteine eine essentielle Rolle in der mitotischen Zellteilung spielen.Zusätzlich habe ich demonstriert, dass imperfekte siRNAs sich zur Induktion von RNAi eignen. Diese imperfekten siRNAs sind entweder aus einem selbstkomplementären RNA Gegenstrang (antisense RNA) gegen das lamin A/C Gen oder aus zwei zueinander komplementären antisense RNAs mit individuellen Zielsequenzen auf der lamin A/C mRNA. Das bahnbrechendste Experiment zeigt die Supression zweier Zielgene durch die Transfektion einer imperfekten siRNA, die zusammengesetzt sind aus zwei antisense RNAs mit Zielsequenzen auf unterschiedlichen Genen.Ein erfolgreiches RNAi Experiment hängt wesentlich von der Transfektioneffizienz mit siRNAs ab. In dieser Arbeit demonstriere ich eine neue Transfektionsmethode, basierend auf Pinozytose. Wenn Zellen mit einer hypertonischen Umgebung konfrontiert werden beginnen sie automatisch mit der Pinozytose. Zur Transfektion werden nun siRNAs mit hypertonischem Medium gemischt und auf diese Weise in pinozytotischen Vesikeln in das Zytoplasma der Zellen transportiert. Durch einen osmotischen Schock in hypotonischem Medium werden diese Vesikel gesprengt, die siRNAs gelangen in das Zytoplasma und stehen somit der RNAi Maschinerie zur Verfügung. Erfolgreiche RNAi konnte in verschiedenen Vertebraten, darunter Mensch, Huhn und Maus, demonstriert werden. Die Anwendbarkeit von RNAi in Zebrafisch Embryos wird jedoch durch eine unklare Situation in der wissenschaftlichen Literatur in Frage gestellt, denn Anwesenheit doppelsträngiger RNA Moleküle verursacht unspezifische Effekte in den Embryos. In dieser Arbeit zeige ich die Anwendung von RNAi in Zelllinien des Zebrafisches. Sowohl in Zellen adulten als auch embryonalen Ursprungs führte RNAi zur sequenzspezifischen Supression endogener wie exogener Zielgene ohne unspezifische Effekte.

Author dc:creator

• Gruber, Jens

Contributors dc:contributor

• Osborn, Mary Prof. Dr.
• Ficner, Ralf Prof. Dr.
• Tuschl, Thomas Dr.

• 570 Biowissenschaften, Biologie
• Biologie
• RNA interferenz
• siRNA
• Transfektion
• funktionelle Genanalyse
• RNA interference
• transfection
• functional gene analysis
• 42.13 Molekularbiologie
• WF 200: Molekularbiologie

Licence

• https://webdoc.sub.gwdg.de/diss/copyr_diss.html

Language dc:language

eng

Identifier

https://dx.doi.org/10.53846/goediss-618
urn:nbn:de:gbv:7-webdoc-64-3
webdoc-64
517961954

OAI identifier oai:identifier

oai:ediss.uni-goettingen.de:11858/00-1735-0000-0006-ABAC-9