Veranschaulichung subzellulärer physikalischer Kräfte biochemischen und mechanischen Ursprungs mittels FRET

Das zelluläre Cytoskelett besteht aus Mikrofilamenten, intermediären Filamenten, Mikrotubuli und einer Reihe von weiteren Proteinen, die seine von dem Zelltyp und von der Zellumgebung abhängige Dynamik kontrollieren. Proteine, die der Rho GTPase Familie angehören, spielen hierbei eine wichtige Rolle. Die RhoA GTPase, zum Beispiel, koordiniert gleichzeitig die Entstehung von Faserbündeln und fokalen Adhäsionen (FA). Die Faserbündel zeichnen sich durch ihre kontrahierenden, auf Aktomyosin basierenden Kräfte aus, die sich auf FA konzentrieren und damit zur Generation der zytoplasmischen Tension beitragen, die wiederum bestimmend für die Zellmorphologie, Adhäsion und Zellmigration ist. Basierend auf den Prinzipien des Förster Resonanz Energie Transfers (FRET) wurde ein optischer Biosensor konstruiert, um den Umfang aktiver, GTP-gebundener RhoA GTPase zu veranschaulichen, deren biochemiche Aktivität zur Entstehung physikalischer Kräfte im zellulären Cytoskelett führt. Der Biosensor wurde durch den Einsatz von alpha-Helices von sukzessiv wachsender Länge optimiert, die der linearen Extension für gute Orientierung (LEGO) dient. Somit wurde eine Methode für das rationale Design eines FRET Biosensors von hoher dynamischer Sensitivitätsreichweite entwickelt. Der beste RhoA GTPase Biosensor, LEGO10, zeigte einen Anstieg der FRET Effizienz, wenn RhoA in der GDP-gebundenen, inaktiven Form vorlag, während eine Verringerung der FRET Effizienz eintrat, wenn die GTP-gebundene Form von RhoA überwog. In FA enthaltene Integrin Moleküle sind integrale Membranproteine, die einen indirekten Kontakt zwischen dem Cytoskelett und der extrazellulären Matrix (EZM) herstellen, so dass ein kontinuierlicher Informationsaustausch zwischen der intra- und extrazellulären Umgebung stattfindet. Dieser Informationsaustausch ist bedeutsam für die Genexpression, das Zellwachstum, die Proliferation und die Zellmotilität. Um diesen Prozess erklären zu können, muss man die raumzeitliche Aktivitätsverteilung von Proteinen und die an dem bidirektionalen Cytoskelett-EZM Informationsaustausch beteiligten Signalkaskaden verstehen. Während der Zelladhäsion oder Zellmotilität müssen Aufbau, Erhalt und Abbau der Adhäsionskontakte mit der EZM koordiniert werden. Diese Kontakte sind für die Erzeugung und Durchleitung von Zugkräften besonders wichtig und unterstehen der Kontrolle der Rho GTPase Proteinfamilie. Um diese Kräfte näher zu erforschen, wurde eine auf Fibronektin basierende EZM konstruiert, die mit den FRET kompatiblen Cy3 und Cy5 Fluorophoren markiert war, so dass eine FRETing Matrix zustande kam. Gleichzeitig konnten GFP-markierte Cytoskelettkomponenten wie Aktin beobachtet werden, da genügend spektrale Separation zu den Cy3 und Cy5 Fluorophoren bestand. Die FRETing Matrix wurde eingesetzt, um raumzeitliche Aspekte der mechanischen Kraftausübung von Zellen während Adhäsion, Ausbreitung und Migration zu veranschaulichen. Umstrukturierungen innerhalb der FRETing Matrix, verursacht durch Kraftausübung der Zellen, bewirkten Änderungen in deren FRET Effizienz, die Rho GTPase abhängig waren und unterhalb von FA und Faserbündeln stattfanden. In den Anfangsstadien der Zellausbreitung - und zwar bevor die Zelle Adhäsionen zu der EZM etablierte - bildeten sich aufgrund von Aktinpolymerisation Ausstülpungen in der Zellmembran. Zelladhäsionen kamen erst in späteren Stadien der Ausbreitung zustande, durch die dann auch diejenigen Kräfte ausgeübt wurden, die zur Herstellung der innerzellulären Tension und Zellpolarität notwendig sind. Die FRETing Matrix wurde somit als ein Biosensor für die kontinuierliche und schnelle Veranschaulichung von Kräften etabliert, die während der dynamischen Interaktion von Zellen mit der EZM ausgeübt werden.

Author dc:creator

• Mitkovski, Miso

Contributors dc:contributor

• Ficner, Ralf Prof. Dr.
• Neher, Erwin Prof. Dr.
• Braus, Gerhard Prof. Dr.
• Heinrich, Ralf Prof. Dr.

• 570 Biowissenschaften, Biologie
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• green fluorescent protein
• 42.03
• 42.12
• 42.13
• 42.15
• WCC 000: Molekulare Biophysik. Biophysikalische Chemie
• WCE 000: Photobiologie {Biophysik}
• WA 310: Mikroskopie {Biologie}
• WA 320: Spektroskopie {Biologie}

Licence

• https://webdoc.sub.gwdg.de/diss/copyr_diss.html

Language dc:language

eng

Identifier

https://dx.doi.org/10.53846/goediss-613
urn:nbn:de:gbv:7-webdoc-612-4
webdoc-612
509220371

OAI identifier oai:identifier

oai:ediss.uni-goettingen.de:11858/00-1735-0000-0006-ABA6-6