Funktionelle Charakterisierung bakterieller Histondeacetylase-ähnlicher Amidohydrolasen (HDAH)

Da bislang in der Literatur nur wenig über posttranslationale Modifikationen in Form von Acetylierungsmustern von Polypeptiden in Prokaryonten bekannt ist, sollte in dieser Arbeit versucht werden, Erkenntnisse über die Prozesse der Deacetylierung zu gewinnen. Es konnte ein Enzym aus einem Stamm Bordetella/Alcaligenes FB188 isoliert werden, welches eine Deacetylierungsreaktion der Substanz cis-(±)-N-[4-(hydroxymethyl) cyclopent-2-enyl]acetamide (NAA) durchführt. Ein zweites Enzym, die PA3774 HDAH aus Pseudomonas aeroginosa konnte ebenfalls isoliert werden. Diese Enzyme weisen signifikante Ähnlichkeiten zu Enzymen der Histondeacetylase-Superfamilie (HDAC, APAH, acuC) auf und wurden deshalb als Histondeacetylase-ähnliche Amidohydrolasen (HDAH) klassifiziert. Um den Kreis der natürlichen Substrate einzuengen, wurde Substratspezifitätsstudien durchgeführt. Acetyl-Polyamine, die natürlichen Substrate der Acteylpolyamin-Amidohydrolasen (APAH), können als natürliche Substrate der FB188 HDAH, trotz einer engen Verwandtschaft zu den APAHs, aufgrund eines nur sehr geringen Umsatzes ausgeschlossen werden. Es scheint anhand der in dieser Arbeit gewonnenen Daten wahrscheinlicher, dass acetylierte Proteine das natürliche Substrat dieser Enzymklasse (HDAH) darstellen, da acetylierte Proteinstrukturen in Form von z.B. acetylierten Hühner-Histonen von der FB188 HDAH umgesetzt wurden. Um diese Thesen zu verifizieren wurden sowohl die FB188 HDAH als auch die PA3774 HDAH in einem fluorogenen HDAC Assay umfassender untersucht. Das Substrat Boc-Lys(Ac)-MCA wurde von beiden Enzymen in gleichem Umfang prozessiert, tripeptidische Substrate vom Aufbau AS1-AS2-Lys(Ac)-MCA wurden sequenzspezifisch ebenfalls gespalten. Im Rahmen von Studien mit weiteren Substraten erwies sich die FB188 HDAH im Gegensatz zur PA3774 HDAH als nicht enantioselektiv gegenüber Boc-L-Lysin(AC)-MCA bzw. Boc-D-Lys(Ac)-MCA. Des weiteren wurden Substratpräferenzen auch anhand von Kompetitions- und Inhibitionsexperimenten untersucht. In diesem Zusammenhang konnte ein neuer, potenter Inhibitor (CypX) identifiziert werden. Anhand von Mutagenese-Studien der FB188 HDAH und weiterführenden Untersuchungen zur Substratspezifität konnte ein in der Literatur postulierter Reaktionsmechanismus eines HDAC-ähnlichen Enzyms (HDLP aus A. aeolicus) nicht in allen Einzelheiten für die FB188 HDAH bestätigt werden. So führten Mutationen von als essentiell postulierten Aminosäuren führten nicht in allen Fällen zum Totalausfall des Enzyms. Auch Substrate mit besseren Abgangsgruppen zeigten nicht den erwarteten, schnelleren Umsatz des Substrates, so dass hier der vorhergesagte Katalysemechanismus, zumindest für die FB188 HDAH, überdacht werden muss. Auf der Suche nach dem natürlichen Substrat der FB188 HDAH konnten zunächst acetylierte Proteine in Zellextrakten aus verschiedenen Bakterien und Archäen nachgewiesen werde. Erste Untersuchungen deuten in diesem Zusammenhang auf ein Protein der Masse von ca. 65 kDa als natürliches Target der FB188 HDAH hin.

Author dc:creator

• Hildmann, Christian

Contributors dc:contributor

• Schwienhorst, Andreas PD Dr.
• Kolmar, Harald PD Dr.
• Ficner, Ralf Prof. Dr.
• Irniger, Stefan PD Dr.

• 570 Biowissenschaften, Biologie
• Biologie
• HDAC
• Histondeacetylase
• Inhibitor
• Enzymtest
• Hochdurchsatz
• HTS;
• histone deacetylase
• assay
• Screening
• 42.13
• WF200

Licence

• https://webdoc.sub.gwdg.de/diss/copyr_diss.html

Language dc:language

ger

Identifier

https://dx.doi.org/10.53846/goediss-609
urn:nbn:de:gbv:7-webdoc-601-3
webdoc-601
501670017

OAI identifier oai:identifier

oai:ediss.uni-goettingen.de:11858/00-1735-0000-0006-ABA2-E