Entwicklung eines humanen Cornea-Modells für die okulotoxische Sicherheitsprüfung

Bis heute existiert keine validierte Alternativmethode, die im Rahmen der Risikobewertung von Chemikalien und Arzneistoffen sowie der toxikologischen Sicherheitsprüfung von Kosmetika den Augenirritations-Test nach Draize am lebenden Kaninchen vollständig ersetzen kann. Für Substanzen mit starkem Augenirritations-Potential kann die Toxizität anhand verschiedener, validierter in vitro Assays im Rahmen einer abgestuften, von der OECD empfohlenen Teststrategie mit hoher Genauigkeit erfasst werden (BCOP-Assay, ICE-Methode). Substanzen mit sehr mildem Augenirritations-Potential können zukünftig möglicherweise durch kommerziell erhältliche, dreidimensionale Cornea-Epithelmodelle identifiziert werden, die sich momentan in der Validierung befinden (EpiOcularTM Modell, SkinEthik HCETM Modell). Dagegen muss insbesondere die Lücke im Bereich der milden bis moderaten Augenirritation durch neue Alternativmethoden geschlossen werden. Die Überprädiktivität/ hohe Sensitivität der dreidimensionalen Epithelmodelle sowie die Forderung nach einem mechanistischen Ansatz, der die Tiefe der cornealen Verletzung durch toxische Substanzen berücksichtigt und damit ermöglicht, die gesamte Bandbreite an Schweregraden okulotoxischer Reaktionen abzudecken (Jester et al., 2001), erfordert die Einbeziehung weiterer cornealer Schichten, Stroma und Endothel, in ein organotypisches in vitro Modell der Cornea. Die vorliegende Arbeit hatte zum Ziel, ein solches, von Zorn-Kruppa et al. etabliertes Komplettmodell der Cornea aus drei humanen, SV40-immortalisierten Zelllinien hinsichtlich des Kulturmediums zu optimieren und diese Endothel (EC)-, Keratocyten (HCK)- und Epithel (HCE)-Zelllinie an ein gemeinsames, möglichst serumfreies Wachstumsmedium zu adaptieren. EC und HCK wurden zudem in Abhängigkeit von Art und Serumgehalt des Kulturmediums hinsichtlich der Frage, ob die organotypischen Merkmale der primären Zellen trotz der SV40-Immortalisierung erhalten geblieben sind, charakterisiert. Die EC-Zelllinie wurde auf ihre Fähigkeit zur interzellulären Kontaktinhibition untersucht, welche nach dem Erlangen der zellulären Konfluenz die Vorraussetzung zur Ausbildung und Aufrechterhaltung eines organotypischen Endothel-Monolayers darstellt (Joyce et al., 2002). Die Keratocytenzelllinie HCK wurde in Monolayer-Kultur und nach Einbettung in die collagenöse Matrix des Stroma-Äquivalents phänotypisch und funktionell sowie in Abhängigkeit von Serum und Wachstumsfaktoren charakterisiert. Insbesondere wurde die Transformation der HCK in fibrotische Phänotypen nach Stimulation mit TGFβ untersucht, welche in vivo an cornealen Wundheilungsreaktionen beteiligt sind (Fini und Stramer, 2005, Jester et al., 1999). Bei der Untersuchung der EC- Zelllinie zeigte sich FKS als obligatorisch für das Zellwachstum, eine Adaption an serumfreie Kulturbedingungen war nicht möglich. Untersuchungen zur Kontaktinhibition ergaben, dass die EC weder zur Ausbildung eines organotypischen Monolayers noch zur Zellkontakt-induzierten Proliferationshemmung in der Lage sind. Dies ist vermutlich auf eine Störung der an der Zellzykluskontrolle beteiligten Mechanismen durch die Immortalisierung mittels Transfektion mit dem SV40-Large-T-Antigen, einem viralen Onkoprotein, zurückzuführen. Die morphologisch korrekte Nachbildung eines endothelialen Monolayers bei der Rekonstruktion des dreidimensionalen Komplettmodells der humanen Cornea nach Zorn-Kruppa ist demnach vorerst nicht möglich. Auch die Implementierung der EC in ein serumfreies Konstrukt konnte nach den vorliegenden Ergebnissen leider nicht erfolgen. Die Keratocytenzelllinie HCK hingegen behielt auch nach Adaption an ein neu entwickeltes serumfreies Medium ihre Proliferationskapazität und kehrte gleichzeitig durch den Entzug von FKS zu einem ruhenden, nicht-kontraktilen Keratocyten-Phänotyp zurück. Die Kultivierung der HCK im serumhaltigen Standardmedium stimulierte zwar das Zellwachstum, führte aber zu einem Verlust der dendritischen Morphologie und zur Differenzierung in fibrotische Phänotypen, Fibroblasten und α-SMA-exprimierende Myofibroblasten. Dies war auf den TGFβ-Gehalt des Fötalen Kälberserums (FKS) zurückzuführen, welcher bekanntlich die Myofibroblasten-Differenzierung primärer Zellen in vitro und in vivo stimuliert. Die Einbettung der HCK in das collagenöse Stroma- Äquivalent resultierte sowohl unter serumfreien als auch unter serumhaltigen Bedingungen in einem Rückgang der α-SMA-Expression im Vergleich zur Monolayer- Kultur, was auf eine Dedifferenzierung des myofibroblastoiden Phänotyps hinweist und eventuell auf einem Verlust der interzellulären Mechanotension durch den Collagen-Kontakt basiert. Die Stimulation mit TGFβ1 (2ng/ml) verminderte die Proliferation der HCK und führte sowohl in der Monolayer- Kultur als auch unter Gel-Bedingungen zu einer Transformation der Zellen in hochkontraktile Myofibroblasten, die eine starke, makroskopisch sichtbare Kontraktion der Stroma-Äquivalente auslösten. Ruhende Keratocyten hingegen besitzen keine kontraktilen Eigenschaften, die Fläche der serumfreien Stroma- Äquivalente blieb deshalb konstant. Demzufolge spiegelte sich der Phänotyp der Stroma-inkorporierten HCK in der Kontraktion der Collagengele wider. Dies ermöglicht eine einfache Einschätzung zur phänotypischen Entwicklung der eingebetteten HCK anhand ihrer kontraktilen Eigenschaften und macht das serumfreie Stroma-Konstrukt zudem zum idealen Baustein eines mechanistischen in vitro Wundheilungsmodells. Abschließend wurde ein komplexes in vitro Testmodell aus dem in dieser Arbeit charakterisierten Stroma-Äquivalent und dem von Seeber et al. charakterisierten Epithel (SE-Modell) sowie ein einfaches dreidimensionales Epithelmodell (EPI-Modell) in Zellkultureinsätzen rekonstruiert und deren Sensitivität gegenüber zwei Detergenzien mit bekanntem Irritationspotential vergleichend untersucht. Viabilitätsuntersuchungen nach Exposition mit TritonX-100 zeigten die Überlegenheit des SE-Modells, dessen Ergebnisse denen kommerziell erhältlicher Epithelmodelle ähnelten, gegenüber dem übermäßig sensitiven EPI-Modell. Versuche mit BAC hingegen ergaben eine gleichermaßen hohe Sensitivität beider Modelle, was vermutlich auf den alternativen Toxizitätsmechanismus dieser Testsubstanz zurückzuführen ist, d.h. einer primär stark Zellmembran-schädigenden Wirkung. Bei ersten Versuchen zur Regenerationsfähigkeit des EPI- und SE-Modells nach Schädigung mit TritonX-100 ließ sich bei beiden Konstrukten innerhalb von 48 Stunden keine vollständige Erholung der Viabilität feststellen, was vermutlich auf einen anhaltenden toxischen Effekt von TritonX-100 zurückzuführen ist. Um eine Eignung dieser rekonstruierten in vitro Cornea-Modelle für die Einstufung des Irritationspotentials chemischer Substanzen sowie die Einschätzung eines persistierenden toxischen Effekts anhand der Regeneration der Modelle belegen zu können, muss allerdings eine großes Spektrum an Substanzen mit unterschiedlichen physiko-chemischen Eigenschaften getestet werden.

Author dc:creator

• Manzer, Anna Katharina

• cornea
• human full-thickness corneal model
• eye irritation
• stroma
• keratocyte transformation
• HCK
• keratocyte cell line
• TGFbeta
• alpha-SMA
• SV40-immortalization
• mechanistic model
• wound healing
• ET50
• EC
• corneal endothelial cell line
• endothelial contact inhibition

Licence dc:rights.uri

• http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen

Language dc:language

ger

Identifier URI

http://dx.doi.org/10.17169/refubium-17136

OAI record oai:identifier

https://refubium.fu-berlin.de/oai/request?verb=GetRecord&metadataPrefix=dim&identifier=oai%3Arefubium.fu-berlin.de%3Afub188%2F12938