Bifunktionale Fusionsproteine : Kombination hochselektiver, direkter FXa Inhibition mit aktivationsspezifischer GP IIb/IIIa Blockade einerseits, und zielgerichtetem Fibrin-Targeting andereseits

Ziel dieser Arbeit war es mittels molekularbiologischer Methoden kleinstmögliche, antikoagulatorisch wirksame Fusionsproteine bestehend aus "single-chain" Antikörperfragmenten und einem potenten, direkten Faktor Xa Inhibitor herzustellen. <br> <br>Single-chain Antikörper sind über einen Linker zu einer "Kette" verbundene Immunglobulin-Derivate, die nur aus den variablen Regionen der schweren und leichten Kette bestehen. Das Tick Anticoagulant Peptide (TAP) ist ein neuartiger Serinprotease-Inhibitor, der sehr effektiv und hochselektiv den Faktor Xa hemmt. In der vorliegenden Arbeit wurde das aus 60 Aminosäuren bestehende Protein an zwei verschiedene single-chain Antikörper fusioniert: 1) an den fibrinspezifischen scFv59d8 2) an den für aktivierte Thrombozyten spezifischen scFvMA2. Die entsprechenden DNA-Stücke wurden mittels der Polymerasekettenreaktion (PCR) fusioniert, in den Vector pHog21 ligiert und in TG1 E. coli exprimiert. Die Hauptschwierigkeit der vorliegenden Promotionsarbeit war die Expression eines korrekt gefalteten Proteins. Eine Optimierung der Proteinexpression und -aufreinigung war nur durch eine Vielzahl systematischer methodischer Untersuchungen möglich. <br> <br>Das Konstrukt scFv59d8-TAP reichert sich lokal am fibrinreichen venösen Thrombus an. Die Fibrinspezifität erlaubt eine hohe TAP Konzentration am Thrombus und somit eine potente Faktor Xa Inhibition auf der Oberfläche des Gerinnsels bei gleichzeitig systemisch niedrigen Konzentrationen an Fusionsprotein. Wir konnten zeigen, dass sich scFv59d8-TAP tatsächlich am Thrombus anreichert und hierdurch zu einer hocheffektiven antikoagulativ wirksamen Substanz wird. <br> <br>Das Protein scFvMA2-TAP vereint gleichzeitig drei herausragende Qualitäten. Erstens blockiert es ausschließlich den aktivierten Zustand des GP IIb/IIIa Rezeptors der Thrombozyten. Zweitens bewirkt die TAP-Komponente des Konstruktes eine potente Faktor Xa Inhibition neben der effektiven Thrombozyteninhibition und drittens reichert sich das TAP genau dort an, wo die Konzentration an Prothrombinasekomplex am größten ist, nämlich unmittelbar auf der Plättchenoberfläche. <br> <br>In weiterführenden Arbeiten sollen nun die beschriebenen Vorteile der hergestellten Fusionsproteine in vivo überprüft werden. Die neu hergestellten Antikoagulativa versprechen eine hohe lokale Wirksamkeit bei reduziertem Blutungsrisiko.

Author dc:creator

• Jaminet, Patrick

Contributors dc:contributor

• Peter, Karlheinz

• GP IIb/IIIa Rezeptor
• Factor Xa
• Targeting
• platelet, bifunctional

Repository record source_url

https://freidok.uni-freiburg.de/data/2466

OAI identifier oai:identifier

oai:freidok.uni-freiburg.de:2466