Röntgenstrukturanalyse der 6-Hydroxy-D-Nikotin-Oxidase aus Arthrobacter nicotinovorans sowie Darstellung und Charakterisierung einer Protein-Protein-Kontaktfläche mit der 6-Phospho-ß-Galaktosidase aus Lactococcus lactis

Die 6-Hydroxy-D-Nikotin-Oxidase (6HDNO) aus Arthrobacter nicotinovorans wurde rekombinant exprimiert, gereinigt und kristallisiert. Die Struktur wurde mit röntgenkristallographischen Methoden in drei Kristallformen bis zu einer Auflösung von 1.9 Å gelöst und verfeinert. Das Enzym katalysiert die enantioselektive Oxidation von 6-Hydroxy-D-Nikotin, dem zweiten Schritt des Nikotinmetabolismus des coryneformen Bakteriums A. nicotinovorans, welches seinen Stickstoff- und Kohlenstoffbedarf allein aus dem Abbau von Nikotin decken kann. <br> In allen Strukturen der 6HDNO sind je zwei Moleküle durch eine kovalente Disulfidbrücke zwischen Cys59-Cys59' über eine lokale zweizählige Achse miteinander verbunden. Es konnte gezeigt werden, daß diese Disulfid-Dimere für die Kristallisation essentiell waren. Jedes Protomer besteht aus 459 Aminosäuren, und läßt sich in die drei Domänen bzw. vier Segmente I, IIa, IIb und III unterteilen. Die Domänen I und II sind an der Bindung des FAD-Cofaktors beteiligt und bilden das von der Rossmann-Faltung abgeleitete Nukleotid-Bindungsmotiv. Die Substratbindungsdomäne III besteht aus einem von <br>alpha-Helices umgebenen, großen siebensträngigen ß-Faltblatt. In der Struktur wurde eine kovalente Bindung zwischen den ND1 des His72 und dem C8alpha des FAD beobachtet und damit frühere Schlußfolgerungen auf eine Bindung über das NE2 Atom korrigiert. Anhand der Struktur konnte außerdem ein Mechanismus für die autokatalytische Ausbildung dieser Bindung postuliert werden. Aufgrund der Gesamtfaltung wurde die 6HDNO der p-Cresol-Methylhydroxylase - Vanillyl-Alkohol Oxidase Familie zugeordnet. In den beiden nächsten Verwandten aus dieser Familie ist das FAD über ähnliche kovalente Bindungen mit der Polypeptidkette verknüpft. <br> Anhand der erhaltenen Struktur sowie durch Vergleiche mit den homologen Strukturen wurde ein Modell des Substratkomplexes erstellt, mit dessen Hilfe ein Reaktionsmechanismus postuliert werden konnte. Das Enzym ist spezifisch für 6-Hydroxy-D-Nikotin (6HDN) und wird durch das L-Enantiomer inhibiert. Diese Beobachtung wurde durch die modellierten Enzymsubstrat- und Enzyminhibitorkomplexe bestätigt. Die Enantioselektivität beruht dabei nicht auf dem Hydridtransfer, sondern auf der begleitenden Deprotonierung. Ein Modell der zur 6HDNO nicht sequenzhomologen 6-Hydroxy-L-Nikotin-Oxidase, welche das L-Enantiomer umsetzt und von 6HDN inhibiert wird, wurde anhand der Struktur des sequenzhomologen Enzyms Monoaminoxidase B erstellt. Auch hier wurde der Einfluß der deprotonierenden Base auf die Spezifität anhand von Substrat- und Inhibitor-Komplexmodellen bestätigt. In einer weiteren Serie von Experimenten wurde die Oberfläche der 6-Phospho-ß-Galaktosidase (PGAL) am Kristallkontakt f-f der Kristallform A so verändert, daß stabile Dimere in Lösung gebildet werden, und es wurde versucht diese strukturell zu charakterisieren. Als Ausgangspunkt für die Mutagenese diente eine Oberflächenmutante, bei der drei geladene Aminosäurereste gegen hydrophobe ausgetauscht worden waren. Mit dieser Mutante, welche zu Beginn der Doktorarbeit hergestellt wurde, ist es gelungen ein nichtkovalentes Dimer in Lösung nachzuweisen. Diese lag aber in einem Monomer-Dimer-Gleichgewicht mit nur 5% Dimeranteil vor, welches durch Solvensänderungen nicht auf die Dimerseite verschoben werden konnte. Deshalb wurden mit Hilfe der bekannten PGAL-Struktur manuell am Computer neue, auf dieser Dreifachmutante basierende, hydrophobe Oberflächenmutanten geplant, um den Dimeranteil zu erhöhen. <br> Insgesamt wurden 21 Mutationen mittels ortsgerichtete Mutagenese erzeugt, rekombinant aus E.coli produziert und bis zur Homogenität gereinigt. Der Dimeranteil der Mutanten war mit 12% - 56% wie erhofft deutlich höher. Die Ausbeute an Dimer war aber aufgrund von Verlusten bei der Reinigung sehr gering und reichte nur für eine begrenzte Anzahl an Kristallisationsexperimenten, welche nicht zu röntgentauglichen Kristallen führten. Um für die Kristallisation ausreichend und vor allem homogenes Dimer zu erhalten, wurde eine alternative Reinigung der PGAL-Mutanten etabliert. Mit dieser auf <br>Ni-NTA-Affinitätschromatographie basierenden Reinigung konnten zur Kristallisation ausreichende Mengen an Dimer produziert werden. Um das Dimer in Lösung zu stabilisieren wurden dafür die optimalen Bedingungen experimentell ermittelt. Kristallisationsexperimente mit Dimer von sieben alternativ gereinigten PGAL-Mutanten unter einer sehr großen Anzahl von Kristallisationsbedingungen führten jedoch nicht zu Kristallen.

Author dc:creator

• Kötter, Jochen

Contributors dc:contributor

• Schulz, Georg E.

• 6-Hydroxy-D-Nikotin-Oxidase
• 6-Phospho-ß-Galaktosidase
• protein crystallography
• autoflavinylation
• enantiomeric inhibition
• flavoenzymes
• nicotine degradation

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