Tetracyclin-Resistenz in Helicobacter pylori : Herstellung und Charakterisierung von definierten 16S rRNA-Mutanten und Etablierung eines Realtime-PCR Ansatzes zur schnellen Resistenzbestimmung

Eine Infektion mit Helicobacter pylori führt zu einer Gastritis und erhöht das Risiko von peptischen Ulzera, Mukosa-assoziierten Lymphomen und Magenkarzinom. Durch die zunehmenden Resistenzen gegen die Antibiotika der ersten Wahl wie Clarithromycin und Amoxicillin, welche in der H. pylori-Eradikationstherapie verwendet werden, nimmt die Bedeutung von alternativen Therapieschemata wie z.B. solchen mit Tetracyclin immer mehr zu. <br>Die weitaus meisten H. pylori-Stämme sind Tetracyclin-sensibel, jedoch hat die Tetracyclin-Resistenz in den letzten Jahren weltweit zugenommen. Der für diese Resistenz verantwortliche Mechanismus scheint eine Mutation in der Tetracyclin-Bindungstelle der 16S rRNA zu sein. Bei resistenten H. pylori-Stämmen wurde in beiden Kopien der 16S rRNA-Gene eine Dreifachmutation von AGA 926-928 zu TTC gefunden. <br>Mit dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob alle drei Substitutionen für die Resistenz notwendig sind oder ob Mutationen von einem oder zwei Basenpaaren ausreichen. Zusätzlich sollte ein Ansatz zur schnellen molekulargenetischen Detektion von resistenten H. pylori-Stämmen etabliert werden. <br>Dazu wurden zunächst Mutanten mit ein, zwei oder drei Basenpaarsubstitutionen in den 16S rRNA-Genen des Tetracyclin-sensiblen Stammes 26695 hergestellt und auf Stabilität, Wachstumsverhalten sowie Resistenzgrad getestet. Später wurde eine Realtime-PCR entwickelt, welche zwischen verschiedenen Mutationen unterscheiden kann. <br>Von den Mutanten galten lediglich die zwei mit einer Dreifachmutation als hochgradig resistent gegen Tetracyclin (MHK 4 - 8 my-g/ml). Mutanten mit einer oder zwei Basenpaar-substitutionen waren zwar mit einer MHK von 1 - 2 my-g/ml deutlich resistenter als der TetS Wildtyp (MHK 0,19 my-g/ml), erreichten aber keine hochgradige klinisch-relevante Resistenz von >= 4 my-g/ml. Bis auf eine Mutante mit einer Basenpaarsubstitution (TGA) waren die übrigen über wiederholte Kultivierungen auf Medien mit und ohne Tetracyclin stabil. Das Wachstum der verschiedenen Mutanten unterschied sich in Tetracyclin-freiem Medium nicht vom Wildtyp. In Medium mit Tetracyclin, in dem der Wildtyp kein Wachstum mehr zeigte, war weiterhin Wachstum der Mutanten möglich. <br>Mit der entwickelten Realtime-PCR konnten die hochgradig resistenten Dreifachmutanten gut von Tetracyclin-sensiblen Stämmen unterschieden werden. Auch eine Abgrenzung der niedriggradig resistenten Mutanten mit einer oder zwei Basenpaarsubstitutionen sowohl von den Dreifachmutanten wie auch vom Wildtyp war ohne weiteres möglich. <br>Momentan kann davon ausgegangen werden, dass nur die Mutation AGA926-928 zu TTC, die bisher in allen untersuchten hoch-resistenten klinischen Isolaten gefunden wurde, zu einer klinisch relevanten Tetracyclin-Resistenz führt. Somit kann bei zunehmender Tetracyclin-Resistenz diese Realtime-PCR bei einer fehlgeschlagenen herkömmlichen Resistenztestung eingesetzt werden, um genotypisch resistente H. pylori-Stämme zu identifizieren.

Author dc:creator

• Berning, Marco

Contributors dc:contributor

• Kist, Manfred

• Helicobacter pylori
• resistance
• antibiotics
• tetracycline

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