{"id":{"repo_id":"freiburg-diss","oai_identifier":"oai:freidok.uni-freiburg.de:2162"},"canonical_url":"https://search.dev.ndltd.org/etd/freiburg-diss/oai:freidok.uni-freiburg.de:2162","repository":{"repo_id":"freiburg-diss","name":"University of Freiburg","base_url":"https://freidok.uni-freiburg.de/oai/oai2.php"},"display":{"title":"Tetracyclin-Resistenz in Helicobacter pylori : Herstellung und Charakterisierung von definierten 16S rRNA-Mutanten und Etablierung eines Realtime-PCR Ansatzes zur schnellen Resistenzbestimmung","abstract":"Eine Infektion mit Helicobacter pylori führt zu einer Gastritis und erhöht das Risiko von peptischen Ulzera, Mukosa-assoziierten Lymphomen und Magenkarzinom. Durch die zunehmenden Resistenzen gegen die Antibiotika der ersten Wahl wie Clarithromycin und Amoxicillin, welche in der H. pylori-Eradikationstherapie verwendet werden, nimmt die Bedeutung von alternativen Therapieschemata wie z.B. solchen mit Tetracyclin immer mehr zu.
Die weitaus meisten H. pylori-Stämme sind Tetracyclin-sensibel, jedoch hat die Tetracyclin-Resistenz in den letzten Jahren weltweit zugenommen. Der für diese Resistenz verantwortliche Mechanismus scheint eine Mutation in der Tetracyclin-Bindungstelle der 16S rRNA zu sein. Bei resistenten H. pylori-Stämmen wurde in beiden Kopien der 16S rRNA-Gene eine Dreifachmutation von AGA 926-928 zu TTC gefunden.
Mit dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob alle drei Substitutionen für die Resistenz notwendig sind oder ob Mutationen von einem oder zwei Basenpaaren ausreichen. Zusätzlich sollte ein Ansatz zur schnellen molekulargenetischen Detektion von resistenten H. pylori-Stämmen etabliert werden.
Dazu wurden zunächst Mutanten mit ein, zwei oder drei Basenpaarsubstitutionen in den 16S rRNA-Genen des Tetracyclin-sensiblen Stammes 26695 hergestellt und auf Stabilität, Wachstumsverhalten sowie Resistenzgrad getestet. Später wurde eine Realtime-PCR entwickelt, welche zwischen verschiedenen Mutationen unterscheiden kann.
Von den Mutanten galten lediglich die zwei mit einer Dreifachmutation als hochgradig resistent gegen Tetracyclin (MHK 4 - 8 my-g/ml). Mutanten mit einer oder zwei Basenpaar-substitutionen waren zwar mit einer MHK von 1 - 2 my-g/ml deutlich resistenter als der TetS Wildtyp (MHK 0,19 my-g/ml), erreichten aber keine hochgradige klinisch-relevante Resistenz von >= 4 my-g/ml. Bis auf eine Mutante mit einer Basenpaarsubstitution (TGA) waren die übrigen über wiederholte Kultivierungen auf Medien mit und ohne Tetracyclin stabil. Das Wachstum der verschiedenen Mutanten unterschied sich in Tetracyclin-freiem Medium nicht vom Wildtyp. In Medium mit Tetracyclin, in dem der Wildtyp kein Wachstum mehr zeigte, war weiterhin Wachstum der Mutanten möglich.
Mit der entwickelten Realtime-PCR konnten die hochgradig resistenten Dreifachmutanten gut von Tetracyclin-sensiblen Stämmen unterschieden werden. Auch eine Abgrenzung der niedriggradig resistenten Mutanten mit einer oder zwei Basenpaarsubstitutionen sowohl von den Dreifachmutanten wie auch vom Wildtyp war ohne weiteres möglich.
Momentan kann davon ausgegangen werden, dass nur die Mutation AGA926-928 zu TTC, die bisher in allen untersuchten hoch-resistenten klinischen Isolaten gefunden wurde, zu einer klinisch relevanten Tetracyclin-Resistenz führt. Somit kann bei zunehmender Tetracyclin-Resistenz diese Realtime-PCR bei einer fehlgeschlagenen herkömmlichen Resistenztestung eingesetzt werden, um genotypisch resistente H. pylori-Stämme zu identifizieren.","abstract_html":"Eine Infektion mit Helicobacter pylori führt zu einer Gastritis und erhöht das Risiko von peptischen Ulzera, Mukosa-assoziierten Lymphomen und Magenkarzinom. Durch die zunehmenden Resistenzen gegen die Antibiotika der ersten Wahl wie Clarithromycin und Amoxicillin, welche in der H. pylori-Eradikationstherapie verwendet werden, nimmt die Bedeutung von alternativen Therapieschemata wie z.B. solchen mit Tetracyclin immer mehr zu. <br>Die weitaus meisten H. pylori-Stämme sind Tetracyclin-sensibel, jedoch hat die Tetracyclin-Resistenz in den letzten Jahren weltweit zugenommen. Der für diese Resistenz verantwortliche Mechanismus scheint eine Mutation in der Tetracyclin-Bindungstelle der 16S rRNA zu sein. Bei resistenten H. pylori-Stämmen wurde in beiden Kopien der 16S rRNA-Gene eine Dreifachmutation von AGA 926-928 zu TTC gefunden. <br>Mit dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob alle drei Substitutionen für die Resistenz notwendig sind oder ob Mutationen von einem oder zwei Basenpaaren ausreichen. Zusätzlich sollte ein Ansatz zur schnellen molekulargenetischen Detektion von resistenten H. pylori-Stämmen etabliert werden. <br>Dazu wurden zunächst Mutanten mit ein, zwei oder drei Basenpaarsubstitutionen in den 16S rRNA-Genen des Tetracyclin-sensiblen Stammes 26695 hergestellt und auf Stabilität, Wachstumsverhalten sowie Resistenzgrad getestet. Später wurde eine Realtime-PCR entwickelt, welche zwischen verschiedenen Mutationen unterscheiden kann. <br>Von den Mutanten galten lediglich die zwei mit einer Dreifachmutation als hochgradig resistent gegen Tetracyclin (MHK 4 - 8 my-g/ml). Mutanten mit einer oder zwei Basenpaar-substitutionen waren zwar mit einer MHK von 1 - 2 my-g/ml deutlich resistenter als der TetS Wildtyp (MHK 0,19 my-g/ml), erreichten aber keine hochgradige klinisch-relevante Resistenz von >= 4 my-g/ml. Bis auf eine Mutante mit einer Basenpaarsubstitution (TGA) waren die übrigen über wiederholte Kultivierungen auf Medien mit und ohne Tetracyclin stabil. 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Die weitaus meisten H. pylori-Stämme sind Tetracyclin-sensibel, jedoch hat die Tetracyclin-Resistenz in den letzten Jahren weltweit zugenommen. Der für diese Resistenz verantwortliche Mechanismus scheint eine Mutation in der Tetracyclin-Bindungstelle der 16S rRNA zu sein. Bei resistenten H. pylori-Stämmen wurde in beiden Kopien der 16S rRNA-Gene eine Dreifachmutation von AGA 926-928 zu TTC gefunden.
Mit dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob alle drei Substitutionen für die Resistenz notwendig sind oder ob Mutationen von einem oder zwei Basenpaaren ausreichen. Zusätzlich sollte ein Ansatz zur schnellen molekulargenetischen Detektion von resistenten H. pylori-Stämmen etabliert werden.
Dazu wurden zunächst Mutanten mit ein, zwei oder drei Basenpaarsubstitutionen in den 16S rRNA-Genen des Tetracyclin-sensiblen Stammes 26695 hergestellt und auf Stabilität, Wachstumsverhalten sowie Resistenzgrad getestet. Später wurde eine Realtime-PCR entwickelt, welche zwischen verschiedenen Mutationen unterscheiden kann.
Von den Mutanten galten lediglich die zwei mit einer Dreifachmutation als hochgradig resistent gegen Tetracyclin (MHK 4 - 8 my-g/ml). Mutanten mit einer oder zwei Basenpaar-substitutionen waren zwar mit einer MHK von 1 - 2 my-g/ml deutlich resistenter als der TetS Wildtyp (MHK 0,19 my-g/ml), erreichten aber keine hochgradige klinisch-relevante Resistenz von >= 4 my-g/ml. Bis auf eine Mutante mit einer Basenpaarsubstitution (TGA) waren die übrigen über wiederholte Kultivierungen auf Medien mit und ohne Tetracyclin stabil. Das Wachstum der verschiedenen Mutanten unterschied sich in Tetracyclin-freiem Medium nicht vom Wildtyp. In Medium mit Tetracyclin, in dem der Wildtyp kein Wachstum mehr zeigte, war weiterhin Wachstum der Mutanten möglich.
Mit der entwickelten Realtime-PCR konnten die hochgradig resistenten Dreifachmutanten gut von Tetracyclin-sensiblen Stämmen unterschieden werden. Auch eine Abgrenzung der niedriggradig resistenten Mutanten mit einer oder zwei Basenpaarsubstitutionen sowohl von den Dreifachmutanten wie auch vom Wildtyp war ohne weiteres möglich.
Momentan kann davon ausgegangen werden, dass nur die Mutation AGA926-928 zu TTC, die bisher in allen untersuchten hoch-resistenten klinischen Isolaten gefunden wurde, zu einer klinisch relevanten Tetracyclin-Resistenz führt. Somit kann bei zunehmender Tetracyclin-Resistenz diese Realtime-PCR bei einer fehlgeschlagenen herkömmlichen Resistenztestung eingesetzt werden, um genotypisch resistente H. pylori-Stämme zu identifizieren.","Helicobacter pylori infection causes gastritis and increases the risk of peptic ulcers, mucosa-associated lymphoma, and gastric cancer. Due to the increasing resistance to first-line antibiotics in H. pylori eradication therapy like clarithromycin and amoxicillin, the importance of alternative therapies such as those containing tetracycline inclines.
By far the most strains are sensitive to tetracycline but tetracycline resistance in H. pylori has recently increased worldwide. The mechanism responsible for resistance seems to be a mutation in the tetracycline binding pocket in 16S rRNA. In resistant H. pylori strains, a triple mutation (AGA926-928 to TTC) has been found in both copies of the 16S rRNA gene.
It has been the objective of this dissertation to investigate whether all three substitutions are inevitable for the resistance or else whether the mutation of one or two of the base pairs is sufficent. Furthermore, the attempt has been made to establish a real-time PCR screening for rapid molecular detection of resistant H. pylori strains.
In order to achieve this, mutants with one, two, and three base pair substitutions in the 16S rRNA genes of the tetracycline-sensitive strain 26695 were created and tested for stability, growth rate, and level of restistance. In addition, a real-time PCR was established which can distinguish between different kinds of mutations.
Only the two mutants with a triple base pair mutation were regarded as high level resistant to tetracycline (MIC 4 – 8 my-g/ml). While mutants with one or two base pair substitutions reached a considerably higher resistance (MIC 1- 2 my-g/ml) than the wild type (MIC 0,19 my-g/ml), they did not confer the high grade clinically relevant resistance of >= 4 my-g/ml. Except for one mutant containing one base pair substitution (TGA), all were stable throughout several cultivation steps on mediums with and without tetracycline. The growth rate of the various mutants did not differ from the wild type in tetracycline-free medium. In medium containing tetracycline on which the wild type showed no growth, the mutants were able to grow further.
Using the thus developed real-time PCR, highly resistant mutants with a triple base pair mutation could clearly be distinguished from the strains sensitive to tetracycline. Also, a differentiation of mutants with a low level resistance with one or two base pair substitutions from the mutants with triple base pair substitutions on the one hand as well as from the wild type on the other was easily achieved.
It can presently be assumed that only the mutation of AGA926-928 to TTC in the 16S rRNA genes which has been found in all high grade resistant clinical isolates confers a clinically relevant tetracycline resistance. In consequence, this novel real-time PCR can be used to identify genotypically resistant H. pylori strains when the conventional testing for resistance has failed."]},{"key":"dc:format.medium","label":"Dc Format Medium","values":["application/pdf"]},{"key":"dc:title","label":"Title","values":["Tetracyclin-Resistenz in Helicobacter pylori : Herstellung und Charakterisierung von definierten 16S rRNA-Mutanten und Etablierung eines Realtime-PCR Ansatzes zur schnellen Resistenzbestimmung","Tetracycline resistance in helicobacter pylori : on the creation and characterisation of defined 16S rRNA mutants and the establishment of a real-time PCR screening for rapid detection of resistant strains"]}]}],"canonical_facts":{"dc:contributor":["Kist, Manfred"],"dc:creator":["Berning, Marco"],"dc:description.abstract":["Eine Infektion mit Helicobacter pylori führt zu einer Gastritis und erhöht das Risiko von peptischen Ulzera, Mukosa-assoziierten Lymphomen und Magenkarzinom. Durch die zunehmenden Resistenzen gegen die Antibiotika der ersten Wahl wie Clarithromycin und Amoxicillin, welche in der H. pylori-Eradikationstherapie verwendet werden, nimmt die Bedeutung von alternativen Therapieschemata wie z.B. solchen mit Tetracyclin immer mehr zu.
Die weitaus meisten H. pylori-Stämme sind Tetracyclin-sensibel, jedoch hat die Tetracyclin-Resistenz in den letzten Jahren weltweit zugenommen. Der für diese Resistenz verantwortliche Mechanismus scheint eine Mutation in der Tetracyclin-Bindungstelle der 16S rRNA zu sein. Bei resistenten H. pylori-Stämmen wurde in beiden Kopien der 16S rRNA-Gene eine Dreifachmutation von AGA 926-928 zu TTC gefunden.
Mit dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob alle drei Substitutionen für die Resistenz notwendig sind oder ob Mutationen von einem oder zwei Basenpaaren ausreichen. Zusätzlich sollte ein Ansatz zur schnellen molekulargenetischen Detektion von resistenten H. pylori-Stämmen etabliert werden.
Dazu wurden zunächst Mutanten mit ein, zwei oder drei Basenpaarsubstitutionen in den 16S rRNA-Genen des Tetracyclin-sensiblen Stammes 26695 hergestellt und auf Stabilität, Wachstumsverhalten sowie Resistenzgrad getestet. Später wurde eine Realtime-PCR entwickelt, welche zwischen verschiedenen Mutationen unterscheiden kann.
Von den Mutanten galten lediglich die zwei mit einer Dreifachmutation als hochgradig resistent gegen Tetracyclin (MHK 4 - 8 my-g/ml). Mutanten mit einer oder zwei Basenpaar-substitutionen waren zwar mit einer MHK von 1 - 2 my-g/ml deutlich resistenter als der TetS Wildtyp (MHK 0,19 my-g/ml), erreichten aber keine hochgradige klinisch-relevante Resistenz von >= 4 my-g/ml. Bis auf eine Mutante mit einer Basenpaarsubstitution (TGA) waren die übrigen über wiederholte Kultivierungen auf Medien mit und ohne Tetracyclin stabil. Das Wachstum der verschiedenen Mutanten unterschied sich in Tetracyclin-freiem Medium nicht vom Wildtyp. In Medium mit Tetracyclin, in dem der Wildtyp kein Wachstum mehr zeigte, war weiterhin Wachstum der Mutanten möglich.
Mit der entwickelten Realtime-PCR konnten die hochgradig resistenten Dreifachmutanten gut von Tetracyclin-sensiblen Stämmen unterschieden werden. Auch eine Abgrenzung der niedriggradig resistenten Mutanten mit einer oder zwei Basenpaarsubstitutionen sowohl von den Dreifachmutanten wie auch vom Wildtyp war ohne weiteres möglich.
Momentan kann davon ausgegangen werden, dass nur die Mutation AGA926-928 zu TTC, die bisher in allen untersuchten hoch-resistenten klinischen Isolaten gefunden wurde, zu einer klinisch relevanten Tetracyclin-Resistenz führt. Somit kann bei zunehmender Tetracyclin-Resistenz diese Realtime-PCR bei einer fehlgeschlagenen herkömmlichen Resistenztestung eingesetzt werden, um genotypisch resistente H. pylori-Stämme zu identifizieren.","Helicobacter pylori infection causes gastritis and increases the risk of peptic ulcers, mucosa-associated lymphoma, and gastric cancer. Due to the increasing resistance to first-line antibiotics in H. pylori eradication therapy like clarithromycin and amoxicillin, the importance of alternative therapies such as those containing tetracycline inclines.
By far the most strains are sensitive to tetracycline but tetracycline resistance in H. pylori has recently increased worldwide. The mechanism responsible for resistance seems to be a mutation in the tetracycline binding pocket in 16S rRNA. In resistant H. pylori strains, a triple mutation (AGA926-928 to TTC) has been found in both copies of the 16S rRNA gene.
It has been the objective of this dissertation to investigate whether all three substitutions are inevitable for the resistance or else whether the mutation of one or two of the base pairs is sufficent. Furthermore, the attempt has been made to establish a real-time PCR screening for rapid molecular detection of resistant H. pylori strains.
In order to achieve this, mutants with one, two, and three base pair substitutions in the 16S rRNA genes of the tetracycline-sensitive strain 26695 were created and tested for stability, growth rate, and level of restistance. In addition, a real-time PCR was established which can distinguish between different kinds of mutations.
Only the two mutants with a triple base pair mutation were regarded as high level resistant to tetracycline (MIC 4 – 8 my-g/ml). While mutants with one or two base pair substitutions reached a considerably higher resistance (MIC 1- 2 my-g/ml) than the wild type (MIC 0,19 my-g/ml), they did not confer the high grade clinically relevant resistance of >= 4 my-g/ml. Except for one mutant containing one base pair substitution (TGA), all were stable throughout several cultivation steps on mediums with and without tetracycline. The growth rate of the various mutants did not differ from the wild type in tetracycline-free medium. In medium containing tetracycline on which the wild type showed no growth, the mutants were able to grow further.
Using the thus developed real-time PCR, highly resistant mutants with a triple base pair mutation could clearly be distinguished from the strains sensitive to tetracycline. Also, a differentiation of mutants with a low level resistance with one or two base pair substitutions from the mutants with triple base pair substitutions on the one hand as well as from the wild type on the other was easily achieved.
It can presently be assumed that only the mutation of AGA926-928 to TTC in the 16S rRNA genes which has been found in all high grade resistant clinical isolates confers a clinically relevant tetracycline resistance. In consequence, this novel real-time PCR can be used to identify genotypically resistant H. pylori strains when the conventional testing for resistance has failed."],"dc:format.medium":["application/pdf"],"dc:subject":["Helicobacter pylori","resistance","antibiotics","tetracycline"],"dc:title":["Tetracyclin-Resistenz in Helicobacter pylori : Herstellung und Charakterisierung von definierten 16S rRNA-Mutanten und Etablierung eines Realtime-PCR Ansatzes zur schnellen Resistenzbestimmung","Tetracycline resistance in helicobacter pylori : on the creation and characterisation of defined 16S rRNA mutants and the establishment of a real-time PCR screening for rapid detection of resistant strains"],"dc:type":["DoctoralThesis"]},"updated_at":"2026-07-24T02:22:40Z"}