Polyenantibiotika aus Streptomyceten : molekularbiologische Untersuchungen zur Biosynthese von Simocyclinon und alpha-Lipomycin

In der vorliegenden Arbeit wurde die Biosynthese der Polyenantibiotika Simocyclinon D8 und alpha-Lipomycin untersucht. <br>Der Stamm S. antibioticus Tü6040 produziert als Hauptderivat Simocyclinon D8, ein natürliches Hybrid-Antibiotikum bestehend aus einem Angucyclinon, einer C-glykosidisch gebundenen D-Olivose, einer Tetraenseitenkette und einem Aminocumarin-Anteil. Je nach verwendetem Medium wird von dem Streptomyceten neben Simocyclinon D8 eine Anzahl weiterer Simocyclinone produziert. Die verschiedenen Simocyclinone unterscheiden sich zum einen durch ganze Strukturelemente voneinander und zum anderen durch Modifizierungen, wie die Acetylierung der D-Olivose an Position C-4 und die Halogenierung des Aminocumarins. <br>Für die Acetylierung der D-Olivose konnte durch heterologe Expression der Nachweis erbracht werden, dass SimB6 diesen Syntheseschritt katalysiert. Für weitere in vitro Untersuchungen wurde die Acetyltransferase SimB6 als His-Tag Protein löslich in E. coli BL21 (DE3) pLysS und S. fradiae AX exprimiert und aufgereinigt. <br>Die Einzigartigkeit der Struktur der Simocyclinone liegt in der Kombination des Polyens mit einem Dideoxyzucker und einem Aminocumarin begründet. Im Rahmen dieser Dissertation wurde die Synthese des Tetraens näher untersucht, das durch eine Typ I Polyketid-Synthase gebildet und im Zusammenspiel verschiedener Enzyme zur Tetraendisäure modifiziert wird. Durch Geninaktivierungsexperimente konnte die Beteiligung der Enzyme SimC4 und SimC5 an der Synthese der Tetraendisäure eindeutig nachgewiesen werden. Vermutlich katalysieren die putative Dioxygenase SimC4 und die putative Aldehyd-Dehydrogenase SimC5 die Oxidation zur Carboxylgruppe an Position C-10 des Polyketides. <br>Die gegen Gram-positive Bakterien biologisch aktive Substanz alpha-Lipomycin wird von S. aureofaciens Tü117 produziert. Sie besteht aus dem Polyenoyl-Tetramsäure Derivat beta-Lipomycin und dem O-glykosidisch verknüpften Dideoxyzucker D-Digitoxose. <br>Um die Biosynthese des Antibiotikums untersuchen zu können, wurde in der vorliegenden Arbeit das alpha-Lipomycin Biosynthese-Gencluster (lip-Cluster) auf den Cosmiden 52-3L13, 52-6I03, 52-5A16 und 52-1F15 einer Cosmid-Bibliothek der genomischen DNA des Stammes S. aureofaciens Tü117 identifiziert. Es wurden ca. 74 kb DNA dieser vier sich überlappenden Cosmide sequenziert. Nach Auswertung der Sequenzdaten konnten innerhalb des sequenzierten Bereiches 28 offene Leserahmen detektiert werden. Über Homologievergleiche wurde den meisten Genen eine putative Funktion zugeordnet und das lip-Cluster auf einen Bereich von ca. 67 kb mit 22 Genen eingegrenzt. Darunter finden sich Gene, deren Genprodukte vermutlich involviert sind in die Biosynthese von alpha-Lipomycin, die Regulation der Lipomycin-Biosynthese und die Ausbildung der Eigenresistenz des Produzenten. <br>Der Nachweis, dass es sich bei dem analysierten Bereich um das lip-Cluster handelt, wurde durch Geninaktivierungsexperimente erbracht. Dazu wurde für den Stamm S. aureofaciens Tü117 zunächst ein Transformations-Protokoll etabliert sowie ein Isolierungs- und Aufreinigungsprotokoll für die Substanz alpha-Lipomycin. <br>Insgesamt erfolgte in der vorliegenden Arbeit die Inaktivierung von fünf Genen (lipNrps, lipMt, lipPks, lipGtf und lipDig3) aus dem lip-Cluster. <br>Die phänotypische Charakterisierung der Mutanten mittels LC-MS Analytik zeigte eindeutig die Beteiligung von LipGtf und LipDig3 an der Biosynthese und Verknüpfung der D-Digitoxose. Bei LipGtf handelt es sich um die Glycosyltransferase, welche den Zucker auf das Aglykon überträgt. Mit weiterführenden Experimenten konnte klar gezeigt werden, dass LipDig3 stereospezifisch die 3-Ketogruppe von NDP-3,4-Diketo-2,6-Dideoxy-D-Glucose reduziert. Die Inaktivierung von lipNrps (nicht-ribosomale Peptid-Synthetase), lipMt (Methyltransferase) und lipPks (Polyketid-Synthase) führte zum Zusammenbruch der Lipomycin-Biosynthese. Dies spiegelt die frühe Beteiligung dieser Enzyme an der Biosynthese des Aglykons wider. <br>Basierend auf den Ergebnissen der Sequenzanalyse und der Geninaktivierungen wurde ein hypothetischer Biosyntheseweg für Lipomycin postuliert.

Author dc:creator

• Bihlmaier, Corina

Contributors dc:contributor

• Bechthold, Andreas

• Polyenantibiotika
• Simocyclinon
• Lipomycin
• Biosynthesegencluster
• Polyketid
• polyene antibiotics
• simocyclinone
• biosynthetic gene cluster
• polyketide

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