Methoden zur Charakterisierung von großtechnisch hergestellten Lipoplexen zum Gentransfer

Die Instabilität von lipidbasierten Gentransfersystemen und die damit verbundene Schwierigkeit der großtechnischen Herstellung und Lagerung ist ein schwerwiegendes Problem für die Entwicklung und Anwendung gentherapeutischer Arzneimittel. <br>Im Rahmen dieser Arbeit wird eine eingehende Charakterisierung von Lipoplexen, durchgeführt, die durch ein kontinuierliches Verfahren mit anschließender Lyophilisation in großem Maßstab hergestellt wurden. Hierzu wurden Methoden für die Analytik der biologischen Aktivität und physikochemischen Stabilität entwickelt. Die Stabilität der Lipoplexe wurde über einen Zeitraum von 11 Monaten verfolgt und es wurde die Reproduzierbarkeit des Herstellverfahrens und der Methoden zur Quantifizierung der Ausgangssubstanzen untersucht. <br>Um strukturelle Einflüsse des Transfektionsreagenzes zu untersuchen wurden Lipoplexe aus DNA und den liposomalen Transfektionsreagenzien DAC-30 und DC-30, welche beide aus dem neutralen Lipid Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE) und den kationischen Cholesterolderivaten DAC-Cholesterol (3ß-[N-(N,N´-dimethylaminoethan)-carbamoyl]-cholesterol) bzw. DC-Cholesterol (3ß-[N-(N´,N´-Dimethylaminoethan)-carbamoyl]-cholesterol) im Verhältnis 7:3 (w/w) bestehen, analysiert. <br>Um die Besonderheiten der großtechnischen Herstellung zu erfassen, wurden zur Entwicklung der Methoden Lipoplexe eingesetzt, die in kleinem Maßstab durch Pipettieren hergestellt wurden und mit den im großen Maßstab hergestellten lyophilisierten und redispergierten Lipoplexen verglichen. Die biologische Aktivität wurde durch die Bestimmung der Transfektionseffizienz mittels Durchflusszytometrie ermittelt. Zur Untersuchung der Auswirkung auf die Zellviabilität erwies sich ebenfalls die durchflusszytometrische Analyse als geeignet. Die physikochemische Stabilität der Lipoplexe wurde auf verschiedene Arten untersucht. Die Partikelgröße und Struktur wurden durch Photonenkorrelationsspektroskopie (PCS) und Cryotransmissions-Elektronenmikroskopie (Cryo-TEM) bestimmt. Die Struktur wurde weiterhin durch die Bestimmung der DNA-Zugänglichkeit in Lipoplexen mittels eines Fluoreszenzassays und Agarosegel-Elektrophorese durchgeführt. Die Oberflächenladung der Partikel wurde durch Zetapotentialmessungen und fluorimetrische Untersuchungen ermittelt. Außerdem wurden Assays zur Quantifizierung der Ausgangssubstanzen Lipid und DNA entwickelt. Spektroskopische Methoden dienten zur Quantifizierung des DOPE-Anteils im Lipid, mit einer HPTLC-Methode konnten sowohl der DOPE-, als auch der Cholesterol-Anteil bestimmt werden. Die Bestimmung des DNA-Anteils wurde ebenfalls mit spektroskopischen Methoden durchgeführt. Die Lyophilisate wurden durch Bestimmung des Restfeuchtegehaltes und durch rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen charakterisiert. <br>Stabilitätsuntersuchungen der lyophilisierten Lipoplexe ergaben, dass die Transfektionseffizienz über den untersuchten Zeitraum nicht abnahm. Partikelgröße und -ladung veränderten sich nicht signifikant, Lipid- und DNA-Gehalt blieben über den gesamten Zeitraum hinweg erhalten. <br>Hinsichtlich der Reproduzierbarkeit des Herstellungsverfahrens konnte festgestellt werden, dass Lipoplexe mit gleichbleibenden Eigenschaften produziert werden konnten. Mit den Methoden zur Quantifizierung von Lipid und DNA wurden einheitliche Ergebnisse erzielt, allerdings ergaben sich zwischen den mit den verschiedenen Methoden erzielten Ergebnissen Unterschiede. <br>Zwischen den physikochemischen Eigenschaften der DAC-30 bzw. DC-30-haltigen Lipoplexe ließen sich keine signifikanten Unterschiede feststellen. Die mit DAC-30-haltigen Lipoplexen erzielte Transfektionseffizienz lag jedoch bei ähnlich ausgeprägter Zytotoxizität deutlich über der biologischen Aktivität der DC-30-haltigen Lipoplexe.

Author dc:creator

• Clement, Jule

Contributors dc:contributor

• Peschka-Süss, Regine

• nicht-viraler Gentransfer
• kationisches Lipid
• großtechnische Herstellung
• Charakterisierungsmethoden
• non-viral gene transfer
• analytical methods
• cationic lipid
• DNA
• large-scale production

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