Untersuchungen zur Bindung und Aufnahme von Hepatitis B-Virus Kapsidprotein-Varianten mit anfusionierten Protein-Transduktions-Domänen durch eukaryonte Zellen

Hintergrund der vorliegenden Arbeit sind bereits publizierte Daten, die zeigen, dass es möglich ist, durch Fusion einer Nuklease (aus Staphylococcus aureus) an das Hepatitis-B-Virus (HBV) Coreprotein (coreSN) neuartige antiviral wirkende, auf Proteinen basierende Inhibitoren der HBV-Replikation zu generieren. Das Fusionsprotein coreSN wird zusammen mit dem Wildtyp-Coreprotein in Nukleokapside eingebaut; die anhängende Nuklease wird dadurch hochspezifisch auf das im Kapsid verpackte Virusgenom gelenkt. Als Inhibitor kann ein solches Protein jedoch nur innerhalb der produzierenden Zellen wirken. <br>Sogenannten Protein-Transduktions-Domänen (PTD), zumeist basischen Peptidsequenzen, wird die Fähigkeit zugesprochen, eukaryonte Zellen zu transduzieren. Es sollte getestet werden, inwieweit PTDs durch Verknüpfung mit coreSN diesem Zellgängigkeit vermitteln können, um den antiviralen Effekt auf benachbarte Zellen zu übertragen. Um eine potentielle Aufnahme in die Zelle leichter detektieren zu können, wurde die Nuklease im coreSN-Konstrukt durch GFP ersetzt. An dieses Modell-Protein wurden dann an unterschiedlichen Positionen der Coreprotein-Sequenz (N-Terminus oder c/e1-Epitop) vier unterschiedliche PTDs genetisch eingefügt. Bei den verwendeten PTDs handelt es sich um das aus HBV PräS2 abgeleitete Translokations-Motiv (TLM) sowie um drei aus dem HIV-1 Tat Protein abgeleitete PTDs: Tat4, NP und NS. Eukaryonte Zellen (HeLa und Vero-Zellen) wurden mit den in E. coli exprimierten fluoreszierenden Fusionsproteinen inkubiert und eine potentielle Bindung und Internalisierung mittels FACS-Analyse und Fluoreszenzmikroskopie untersucht. In Einklang mit neuen Literaturdaten konnte eine spezifische Bindung nachgewiesen werden; der eindeutige Nachweis einer intrazellulären Lokalisation der Fusionsproteine war aber nicht möglich. Zur Erhöhung der Sensitivität wurde daher zusätzlich ein basisches Kernlokalisation-Signal (Triplikat des NLS des SV40 Virus T-Antigens; NLS3) an die PTD-GFP-Fusionsproteine verknüpft, in Erwartung, dass in die Zelle aufgenommenes Fusionsprotein dadurch im Kern akkumuliert. Die mit den so modifizierten Fusionsproteinen behandelten Zellen wiesen eine Zunahme der Fluoreszenzintensität auf; fluoreszenzmikroskopisch war jedoch keine Kernlokalisation der Fusionsproteine zu beobachten. Die Ergebnisse dieser Arbeit, die im Gegensatz zu bereits publizierten Ergebnissen unter Verwendung von lebenden, nicht fixierten Zellen generiert wurden, lassen nicht auf eine Protein-transduzierende Aktivität der verwendeten PTDs schliessen. <br>Bei weiteren Untersuchungen stellte sich heraus, dass NLS3 per se schon zu einer Bindung der Fusionsproteine an Zellen führte. Auch die basische Nukleinsäurebindungsdomäne des HBV-Coreproteins zeigte diese Fähigkeit. Sowohl die Bindung der Nukleinsäurebindungsdomäne des HBV-Coreproteins als auch die von NLS3 und der basischen PTDs an Zellen war durch Heparin inhibierbar. Die in der FACS-Analyse beobachteten Fluoreszenzzunahmen nach Inkubation mit den verschiedenen Fusionsproteinen basieren möglicherweise auf einer elektrostatischen Wechselwirkung der basischen Peptidsequenzen mit sauren Komponenten der extrazellulären Matrix. Dies konnte mit Hilfe der Oberflächen-Plasmon-Resonanz Technik bestätigt werden, da hier eine starke Bindungsaffinität zwischen der basischen C-terminalen Sequenz des HBV Coreproteins, dem NLS3 sowie der basischen PTDs und Heparansulfat nachgewiesen werden konnte. <br>Aufgrund des aus den dargestellten Experimenten begründeten Zweifels an der proteintransduzierenden Aktivität von PTDs, scheint die Nutzung eines PTD-coreSN Fusionsproteins als antivirales Agens zum gegenwärtigen Zeitpunkt nicht möglich.

Author dc:creator

• Bendahmane, Sanaa

Contributors dc:contributor

• Nassal, Michael

Repository record source_url

https://freidok.uni-freiburg.de/data/1887

OAI identifier oai:identifier

oai:freidok.uni-freiburg.de:1887