Neuronale in-vitro Differenzierung von murinen homozygoten Pbx1 Knock-out embryonalen Stammzellen : ein System zum Studium der Funktion und zur Identifikation potentieller Zielgene des Pbx1-Homeoboxproteins während der zellulären Differenzierung

Die Expression des PBX1-Gens ist essentiell für die normale Embryogenese. PBX1-knock-out-(K.O.)Mäuse sterben früh während der embryonalen Entwicklung mit einer Aplasie und Hypoplasie multipler Organsysteme. Dies verhindert eine detaillierte Analyse des Effektes eines PBX1-K.O.s auf die neuronale Entwicklung, die deshalb von besonderem Interesse ist, weil PBX1 embryonal auch in Regionen aktiver Neurogenese besonders stark exprimiert wird. Daraus ergab sich als Ziel dieser Arbeit die Etablierung eines neuronalen in-vitro-Differenzierungssystems embryonaler Stammzellen (ES-Zellen). Dies umgeht das Problem der frühen Letalität von PBX1-K.O.-Mäusen und erlaubt so die Analyse der Auswirkungen des Verlustes von PBX1 während der neuronalen Differenzierung auf zellulärer Ebene. <br>Unter Verwendung des CreLox-Systems wurden Einzel- und Doppelallel-PBX1-K.O.-ES-Zellen aus Wildtyp (WT) murinen embryonalen Stammzellen erzeugt. Nach der Etablierung des in-vitro-Differenzierungssystems wurden PBX1(+/+), PBX1(+/-) und PBX1(-/-)-ES-Zelllinien neuronal differenziert. Die Zelllinien der verschiedenen Genotypen wurden untereinander in unterschiedlichen Differenzierungsstadien morphologisch und immunzytochemisch verglichen und anschließend durch RT-PCR, Genomexpressionsanalysen mit Microarrays sowie Northern-Blot auf molekularer Ebene vergleichend charakterisiert. <br>Lichtmikroskopisch-morphologische Analysen und immunzytochemische Untersuchungen zeigten, dass die beiden PBX1-K.O.-Zelllinien mehr neuronalisierten als die WT-Zelllinien. Die semiquantitativen RT-PCR-Ergebnisse und die Mikroarray-Genexpressionsanalyse bestätigten diese Beobachtung insofern, als die neuronalen Marker nach der zellulären Differenzierung von den PBX1(-/-)-Zelllinien stärker exprimiert wurden als von den WT-Zelllinien. Zusätzlich zeigte die Mikroarray-Analyse, dass die PBX1(-/-)-Zellen im Vergleich zu den WT-Zellen mehr mesodermale Marker und weniger endodermale Marker exprimierten. Während der zellulären Differenzierung traten bei WNT1, FGF15, IGF1, IGF2, IGF1R, IGF2R und Colipase besonders große Unterschiede im Vergleich der Genexpressionsmuster von PBX1(+/+)-, PBX1(+/-)- und PBX1(-/-)-ES-Zellen auf. <br>Die Ergebnisse unserer Untersuchungen lassen den Schluss zu, dass PBX1(-/-)-Zellen während der zellulären Differenzierung neuroektodermal und mesodermal differenzieren, während der endodermale Differenzierungsweg supprimiert wird. Die neuronale Differenzierung der PBX1-K.O.-Zellen in vitro erlaubt auch Rückschlüsse auf potentielle Zielgene von PBX1. So könnten die zwischen PBX1-K.O.-Zellen und WT-Zellen differenziell exprimierten Gene (insbesondere WNT1, FGF15, IGFs und ihre Rezeptoren, sowie Colipase) als Zielgene von PBX1 eine Rolle spielen. <br>Die vorliegende Arbeit zeigt erstmals, dass eine Kombination des neuronalen in-vitro-Differenzierungssytems mit einem Knock-out-System möglich ist. Das hier beschriebene Verfahren könnte zukünftig sowohl auf andere Differenzierungswege, wie z.B. von PBX1-K.O.-Zellen zu beta-Inselzellen, als auch auf andere ES-Zellen mit anderen K.O.s übertragen werden und so die Funktionsanalyse verschiedener ausgeschalteter Gene auf zellulärer Ebene in spezifischen Differenzierungszusammenhängen ermöglichen.

Author dc:creator

• Jürgens, Anne Siobhain

Contributors dc:contributor

• Mertelsmann, Roland

• PBX1, Zielgen
• in vitro Differenzierung
• PBX1
• embryonic stem cell
• in vitro differentiation
• target gene

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