{"id":{"repo_id":"freiburg-diss","oai_identifier":"oai:freidok.uni-freiburg.de:1882"},"canonical_url":"https://search.dev.ndltd.org/etd/freiburg-diss/oai:freidok.uni-freiburg.de:1882","repository":{"repo_id":"freiburg-diss","name":"University of Freiburg","base_url":"https://freidok.uni-freiburg.de/oai/oai2.php"},"display":{"title":"Neuronale in-vitro Differenzierung von murinen homozygoten Pbx1 Knock-out embryonalen Stammzellen : ein System zum Studium der Funktion und zur Identifikation potentieller Zielgene des Pbx1-Homeoboxproteins während der zellulären Differenzierung","abstract":"Die Expression des PBX1-Gens ist essentiell für die normale Embryogenese. PBX1-knock-out-(K.O.)Mäuse sterben früh während der embryonalen Entwicklung mit einer Aplasie und Hypoplasie multipler Organsysteme. Dies verhindert eine detaillierte Analyse des Effektes eines PBX1-K.O.s auf die neuronale Entwicklung, die deshalb von besonderem Interesse ist, weil PBX1 embryonal auch in Regionen aktiver Neurogenese besonders stark exprimiert wird. Daraus ergab sich als Ziel dieser Arbeit die Etablierung eines neuronalen in-vitro-Differenzierungssystems embryonaler Stammzellen (ES-Zellen). Dies umgeht das Problem der frühen Letalität von PBX1-K.O.-Mäusen und erlaubt so die Analyse der Auswirkungen des Verlustes von PBX1 während der neuronalen Differenzierung auf zellulärer Ebene. <br>Unter Verwendung des CreLox-Systems wurden Einzel- und Doppelallel-PBX1-K.O.-ES-Zellen aus Wildtyp (WT) murinen embryonalen Stammzellen erzeugt. Nach der Etablierung des in-vitro-Differenzierungssystems wurden PBX1(+/+), PBX1(+/-) und PBX1(-/-)-ES-Zelllinien neuronal differenziert. Die Zelllinien der verschiedenen Genotypen wurden untereinander in unterschiedlichen Differenzierungsstadien morphologisch und immunzytochemisch verglichen und anschließend durch RT-PCR, Genomexpressionsanalysen mit Microarrays sowie Northern-Blot auf molekularer Ebene vergleichend charakterisiert. <br>Lichtmikroskopisch-morphologische Analysen und immunzytochemische Untersuchungen zeigten, dass die beiden PBX1-K.O.-Zelllinien mehr neuronalisierten als die WT-Zelllinien. Die semiquantitativen RT-PCR-Ergebnisse und die Mikroarray-Genexpressionsanalyse bestätigten diese Beobachtung insofern, als die neuronalen Marker nach der zellulären Differenzierung von den PBX1(-/-)-Zelllinien stärker exprimiert wurden als von den WT-Zelllinien. Zusätzlich zeigte die Mikroarray-Analyse, dass die PBX1(-/-)-Zellen im Vergleich zu den WT-Zellen mehr mesodermale Marker und weniger endodermale Marker exprimierten. Während der zellulären Differenzierung traten bei WNT1, FGF15, IGF1, IGF2, IGF1R, IGF2R und Colipase besonders große Unterschiede im Vergleich der Genexpressionsmuster von PBX1(+/+)-, PBX1(+/-)- und PBX1(-/-)-ES-Zellen auf. <br>Die Ergebnisse unserer Untersuchungen lassen den Schluss zu, dass PBX1(-/-)-Zellen während der zellulären Differenzierung neuroektodermal und mesodermal differenzieren, während der endodermale Differenzierungsweg supprimiert wird. Die neuronale Differenzierung der PBX1-K.O.-Zellen in vitro erlaubt auch Rückschlüsse auf potentielle Zielgene von PBX1. So könnten die zwischen PBX1-K.O.-Zellen und WT-Zellen differenziell exprimierten Gene (insbesondere WNT1, FGF15, IGFs und ihre Rezeptoren, sowie Colipase) als Zielgene von PBX1 eine Rolle spielen. <br>Die vorliegende Arbeit zeigt erstmals, dass eine Kombination des neuronalen in-vitro-Differenzierungssytems mit einem Knock-out-System möglich ist. Das hier beschriebene Verfahren könnte zukünftig sowohl auf andere Differenzierungswege, wie z.B. von PBX1-K.O.-Zellen zu beta-Inselzellen, als auch auf andere ES-Zellen mit anderen K.O.s übertragen werden und so die Funktionsanalyse verschiedener ausgeschalteter Gene auf zellulärer Ebene in spezifischen Differenzierungszusammenhängen ermöglichen.","abstract_html":"Die Expression des PBX1-Gens ist essentiell für die normale Embryogenese. PBX1-knock-out-(K.O.)Mäuse sterben früh während der embryonalen Entwicklung mit einer Aplasie und Hypoplasie multipler Organsysteme. Dies verhindert eine detaillierte Analyse des Effektes eines PBX1-K.O.s auf die neuronale Entwicklung, die deshalb von besonderem Interesse ist, weil PBX1 embryonal auch in Regionen aktiver Neurogenese besonders stark exprimiert wird. Daraus ergab sich als Ziel dieser Arbeit die Etablierung eines neuronalen in-vitro-Differenzierungssystems embryonaler Stammzellen (ES-Zellen). 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The effect of the inactivation of PBX1 was analyzed at molecular level. <br>Utilizing the Cre-loxP system, we deleted functionally an important part of the homeo-domain (HD) of Pbx1, in one and both alleles of the PBX1 gene in the ES cells. After establishment of the in vitro differentiation system we differentiated the wild-type (PBX1+/+) and Pbx1 mutant ES cells (PBX1+/- and PBX1 -/-) into the neuronal cell lineage. We then compared the morphology and gene expression of the cell lines with different genotypes at defined stages of differentiation by light microscopy analysis, immunhistochemistry, RT PCR analysis, genome-wide expression analysis and Northern Blot Analysis. <br>The light microscopy analysis and immunhistochemistry analysis indicated that the PBX1(-/-) cell lines differentiated more efficiently into the neuronal cell lineage. The RT PCR Analysis and the genome-wide expression analysis confirmed this by showing that the differentiated PBX1 (-/-) cell lines have a higher expression level of neuronal marker than the PBX1 (+/+) cell lines. In addition, the genome-wide expression analysis showed that the PBX1(-/-) cell lines expressed more mesodermal marker and less endodermal marker than the PBX1 (+/+) cell lines. During the cellular differentiation we could detect marked changes in the expression level of WNT1, FGF15, IGF1, IGF2, IGF1R, IGF2R and Colipase between the PBX1 (+/+) and PBX1 (-/-) cell lines. <br>Our Results indicate the PBX1(-/-) cell line induce different neuroectodermal and mesodermal cell types and suppresses the expression of endodermal genes. The in vitro differentiation system into the neuronal cell is also a system to identify possible target genes of PBX1. The genes (WNT1, FGF15, IGF1, IGF2, IGF1R, IGF2R and Colipase) with marked changes in the expression level between the PBX1 (+/+) and PBX1 (-/-) cell lines can be considered as possible target genes. <br>For the first time we showed that a combination between the in vitro differentiation system into the neuronal cell lineage and a knock-out system is possible. The method we describe could both be assigned to other differentiation systems, e.g. differentiation of PBX1 (-/-) cell line into beta-islet cells and could be assigned to other knock-out ES cells. We describe a system, which can be used to characterize the function of knock out genes at cellular level."]},{"key":"dc:format.medium","label":"Dc Format Medium","values":["application/pdf"]},{"key":"dc:title","label":"Title","values":["Neuronale in-vitro Differenzierung von murinen homozygoten Pbx1 Knock-out embryonalen Stammzellen : ein System zum Studium der Funktion und zur Identifikation potentieller Zielgene des Pbx1-Homeoboxproteins während der zellulären Differenzierung","Neuronal in-vitro differentiation of murine homozygous PBX1 knock-out embryonic stem cells : a system to identify and study potential target genes of PBX1 during cellular differentiation"]}]}],"canonical_facts":{"dc:contributor":["Mertelsmann, Roland"],"dc:creator":["Jürgens, Anne Siobhain"],"dc:description.abstract":["Die Expression des PBX1-Gens ist essentiell für die normale Embryogenese. 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Das hier beschriebene Verfahren könnte zukünftig sowohl auf andere Differenzierungswege, wie z.B. von PBX1-K.O.-Zellen zu beta-Inselzellen, als auch auf andere ES-Zellen mit anderen K.O.s übertragen werden und so die Funktionsanalyse verschiedener ausgeschalteter Gene auf zellulärer Ebene in spezifischen Differenzierungszusammenhängen ermöglichen.","The expression of the PBX1 gene is essential for normal embryogenesis. Inactivation of the Pbx1 gene in mice results in mid gestation lethality associated with aplasia and hypoplasia of multiple organs. This prevents a detailed analysis of the effect of the PBX1 gene in neuronal development. Interestingly PBX1 is expressed in regions of active neurogenesis. Therefore the aim of this project was to establish an in-vitro differentiation system of embryonic stem cell into the neuronal cell lineage, circumventing the very early embryonic lethality of PBX1 knock-out mice. 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