Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G. als Bioreaktor : Proteinzielsteuerung und Produktion von rekombinantem humanem Blutgerinnungsfaktor IX

Das Kooperationsprojekt "Physcomitrella patens als Bioreaktor zur Produktion heterologer, pharmazeutisch relevanter Proteine" hat zum Ziel, das Laubmoos als Produktionssystem zu etablieren. Vorteile des Mooses gegenüber den zumeist verwendeten Säugerzelllinien liegen vor allem in seiner Unempfindlichkeit, hohen Wachstumsraten und den sich daraus ergebenden Möglichkeiten für eine Vergrößerung des Kulturmaßstabs. Darüber hinaus besteht kein Risiko einer Produktkontamination mit Humanpathogenen. Als höherer Eukaryot ist Physcomitrella in der Lage, komplexe, posttranslationale Modifikationen durchzuführen. Die innerhalb der Pflanzen einzigartig hohe, und damit gentechnisch nutzbare Rate homologer Rekombinationsereignisse ermöglicht unter anderem auch die Humanisierung des pflanzlichen Glykosylierungsmusters. <br>In der vorliegenden Arbeit wurden zwei Themenkomplexe des Verbundprojektes bearbeitet. Zur Optimierung der Sekretion rekombinanter Proteine wurde zunächst die Funktionalität eines humanen Signalpeptids analysiert. Die Suche nach einem mooseigenen Signal, das dem humanen gegenüber gestellt werden sollte, führte zur Isolierung von PpAP1, einer neuen, vakuolär lokalisierten Protease. Durch Fusion des PpAP1-Signalpeptids an GFP gelang zum ersten Mal in lebenden Zellen eines Bryophyten die detaillierte Darstellung des Endomembransystems aus ER und Golgi mithilfe von CLS-Mikroskopie. Diese hohe Auflösung des ER-Netztwerks war mit einer GFP-Fusion des humanen Signals nicht möglich, was eine geringere Sekretionseffizienz desselben vermuten ließ. Bestätigt wurde diese Annahme dann durch einen auf GST-Fusionen basierenden quantitativen Vergleich. Die bis zu fünffach höhere Sekretionseffizienz des endogenen Signalpeptids schlägt sich mit gleichem Wert auch in der Produktausbeute des Physcomitrella-Systems nieder. <br>Im zweiten Abschnitt der Arbeit wurde durch die Produktion des komplexen Blutgerrinungsproteins Faktor IX die Leistungsfähigkeit des Systems unter Beweis gestellt. Methodischen Vorarbeiten an Faktor IX-transgenen Pflanzen folgte die Erstellung einer zweiten, dreifach transgenen Moosgeneration. Diese Linien wurden, abgesehen von Faktor IX, noch mit zwei weiteren Expressionskassetten transformiert. Sie kodieren die für die posttranslationale Reifung von Faktor IX essentiellen Enzyme PACE und GGC, die im Moos nicht vorhanden sind. Durch homologe Integration der Konstrukte in die Genorte zweier Glykosyltransferasen sollte die Humanisierung der Produktglykosylierung bewirkt werden. Nach umfangreichen Analysen gelang die Isolierung von dreizehn Linien, die alle drei Transgene exprimieren. Drei dieser Pflanzen sind zusätzlich in einem der Glykosyxltransferasegene deletiert. Eine dieser drei Pflanzen wurde im 5l-Bioreaktor kultiviert, in dessen Kulturmedium schließlich rekombinanter Faktor IX nachgewiesen werden konnte. <br>Mit der Produktion dieses komplexen humanen Plasmaproteins ist es gelungen, die Leistungsfähigkeit des Produktionssystems Physcomitrella unter Beweis zu stellen, das künftig dazu beitragen könnte, den Engpass bei der Produktion rekombinanter Proteinpharmazeutika zu lösen.

Author dc:creator

• Schaaf, Andreas

Contributors dc:contributor

• Reski, Ralf

• molecular farming
• aspartische Protease
• Vakuole
• GST
• moss
• bioreactor
• secretion
• haemophilia B
• factor IX

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