Der Proteintransport in Rhodobacter capsulatus und Escherichia coli über das Tat-Transportsystem

Einige Proteine müssen nach ihrer Synthese im Cytoplasma an ihre Bestimmungsorte transportiert werden. Im gefalteten und cofaktortragenden Zustand werden sie posttranslational über den Tat-Weg (twin arginine translocation) in das Periplasma transloziert. Charakteristisch für die Tat-Substrate ist das Doppelarginin-haltige S-R-R-x-F-L-K-Konsensusmotiv in der Signalsequenz. Das Tat-Translokon wird in E. coli von den Membranproteinen TatA, TatB- und TatC gebildet. Über den Transport-Mechanismus ist bislang wenig bekannt. <br>Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Tat-Transport in den beiden Organismen Rhodobacter capsulatus und Escherichia coli untersucht. Zuerst wurde durch eine erfolgreiche Komplementation einer E. coli &#916;tatABCDE-Mutante nachgewiesen, dass die R. capsulatus Tat-Proteine, die zu ca. 29 % zu den E. coli Proteinen TatA, TatB und TatC homolog sind, tatsächlich funktionell sind. Der Funktionsnachweis im in vitro-System gelang dagegen nicht. <br>In einem weiteren Teil der Arbeit wurde die Energetisierung des Tat-Mechanismus untersucht. Durch hohe Konzentrationen KAc konnte die Translokation des Modellproteins pSufI in die Membranvesikel, die die E. coli Tat-Proteine tragen, signifikant erhöht werden. Dies war durch die Erhöhung des pH-Gradient bedingt. Durch Verwendung des K+/H+-Ionophors Nigericin wurde dieses Ergebnis bestätigt. Da durch das K+-Ionophor Valinomycin die Translokation von pSufI verringert wurde, wurde die Abhängigkeit vom elektrochemischen Membranpotential gezeigt. <br>Mit Hilfe eines chemischen und eines photoaktivierbaren, ortspezifischen Quervernetzers wurden einzelne Stadien des Tat-Targetings untersucht. Durch den Vergleich von in vitro syntethisierten Ribosomen-assoziierten naszierenden Ketten des Tat-abhängigen pSufI, des Sec-abhängigen pOmpA und des Fusionsproteins HybOmpA, das aus dem reifen Teil von OmpA und der Tat-Signalsequenz von HybA besteht, konnte gezeigt werden, dass Tat-Substrate am Ribosom wie andere sekretorische Proteine an Trigger Faktor, ein am Ribosom lokalisiertes Chaperon, binden. Dabei konnte eine Interaktion von Trigger Faktor mit der Tat-Signalsequenz gezeigt werden. Eine cotranslationale Interaktion mit Tat-spezifischen Faktoren wurde nicht beobachtet. Nach vollständiger Synthese interagierte pSufI über die Signalsequenz mit einem 30 kDa großen Protein. Diese Bindung wurde nur in Abwesenheit von Vesikeln beobachtet, so dass es sich wahrscheinlich um einen Tat-spezifischen Targetingfaktor handelt. Es gelang bisher weder über in vitro noch in vivo Studien diesen Faktor zu identifizieren.

Author dc:creator

• Lüke, Iris

Contributors dc:contributor

• Müller, Matthias

• Tat
• proteintranslocation

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