{"id":{"repo_id":"freiburg-diss","oai_identifier":"oai:freidok.uni-freiburg.de:1415"},"canonical_url":"https://search.dev.ndltd.org/etd/freiburg-diss/oai:freidok.uni-freiburg.de:1415","repository":{"repo_id":"freiburg-diss","name":"University of Freiburg","base_url":"https://freidok.uni-freiburg.de/oai/oai2.php"},"display":{"title":"Der Proteintransport in Rhodobacter capsulatus und Escherichia coli über das Tat-Transportsystem","abstract":"Einige Proteine müssen nach ihrer Synthese im Cytoplasma an ihre Bestimmungsorte transportiert werden. Im gefalteten und cofaktortragenden Zustand werden sie posttranslational über den Tat-Weg (twin arginine translocation) in das Periplasma transloziert. Charakteristisch für die Tat-Substrate ist das Doppelarginin-haltige S-R-R-x-F-L-K-Konsensusmotiv in der Signalsequenz. Das Tat-Translokon wird in E. coli von den Membranproteinen TatA, TatB- und TatC gebildet. Über den Transport-Mechanismus ist bislang wenig bekannt.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Tat-Transport in den beiden Organismen Rhodobacter capsulatus und Escherichia coli untersucht. Zuerst wurde durch eine erfolgreiche Komplementation einer E. coli ΔtatABCDE-Mutante nachgewiesen, dass die R. capsulatus Tat-Proteine, die zu ca. 29 % zu den E. coli Proteinen TatA, TatB und TatC homolog sind, tatsächlich funktionell sind. Der Funktionsnachweis im in vitro-System gelang dagegen nicht.
In einem weiteren Teil der Arbeit wurde die Energetisierung des Tat-Mechanismus untersucht. Durch hohe Konzentrationen KAc konnte die Translokation des Modellproteins pSufI in die Membranvesikel, die die E. coli Tat-Proteine tragen, signifikant erhöht werden. Dies war durch die Erhöhung des pH-Gradient bedingt. Durch Verwendung des K+/H+-Ionophors Nigericin wurde dieses Ergebnis bestätigt. Da durch das K+-Ionophor Valinomycin die Translokation von pSufI verringert wurde, wurde die Abhängigkeit vom elektrochemischen Membranpotential gezeigt.
Mit Hilfe eines chemischen und eines photoaktivierbaren, ortspezifischen Quervernetzers wurden einzelne Stadien des Tat-Targetings untersucht. Durch den Vergleich von in vitro syntethisierten Ribosomen-assoziierten naszierenden Ketten des Tat-abhängigen pSufI, des Sec-abhängigen pOmpA und des Fusionsproteins HybOmpA, das aus dem reifen Teil von OmpA und der Tat-Signalsequenz von HybA besteht, konnte gezeigt werden, dass Tat-Substrate am Ribosom wie andere sekretorische Proteine an Trigger Faktor, ein am Ribosom lokalisiertes Chaperon, binden. Dabei konnte eine Interaktion von Trigger Faktor mit der Tat-Signalsequenz gezeigt werden. Eine cotranslationale Interaktion mit Tat-spezifischen Faktoren wurde nicht beobachtet. Nach vollständiger Synthese interagierte pSufI über die Signalsequenz mit einem 30 kDa großen Protein. Diese Bindung wurde nur in Abwesenheit von Vesikeln beobachtet, so dass es sich wahrscheinlich um einen Tat-spezifischen Targetingfaktor handelt. Es gelang bisher weder über in vitro noch in vivo Studien diesen Faktor zu identifizieren.","abstract_html":"Einige Proteine müssen nach ihrer Synthese im Cytoplasma an ihre Bestimmungsorte transportiert werden. Im gefalteten und cofaktortragenden Zustand werden sie posttranslational über den Tat-Weg (twin arginine translocation) in das Periplasma transloziert. Charakteristisch für die Tat-Substrate ist das Doppelarginin-haltige S-R-R-x-F-L-K-Konsensusmotiv in der Signalsequenz. Das Tat-Translokon wird in E. coli von den Membranproteinen TatA, TatB- und TatC gebildet. Über den Transport-Mechanismus ist bislang wenig bekannt. <br>Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Tat-Transport in den beiden Organismen Rhodobacter capsulatus und Escherichia coli untersucht. Zuerst wurde durch eine erfolgreiche Komplementation einer E. coli ΔtatABCDE-Mutante nachgewiesen, dass die R. capsulatus Tat-Proteine, die zu ca. 29 % zu den E. coli Proteinen TatA, TatB und TatC homolog sind, tatsächlich funktionell sind. Der Funktionsnachweis im in vitro-System gelang dagegen nicht. <br>In einem weiteren Teil der Arbeit wurde die Energetisierung des Tat-Mechanismus untersucht. Durch hohe Konzentrationen KAc konnte die Translokation des Modellproteins pSufI in die Membranvesikel, die die E. coli Tat-Proteine tragen, signifikant erhöht werden. Dies war durch die Erhöhung des pH-Gradient bedingt. Durch Verwendung des K+/H+-Ionophors Nigericin wurde dieses Ergebnis bestätigt. Da durch das K+-Ionophor Valinomycin die Translokation von pSufI verringert wurde, wurde die Abhängigkeit vom elektrochemischen Membranpotential gezeigt. <br>Mit Hilfe eines chemischen und eines photoaktivierbaren, ortspezifischen Quervernetzers wurden einzelne Stadien des Tat-Targetings untersucht. Durch den Vergleich von in vitro syntethisierten Ribosomen-assoziierten naszierenden Ketten des Tat-abhängigen pSufI, des Sec-abhängigen pOmpA und des Fusionsproteins HybOmpA, das aus dem reifen Teil von OmpA und der Tat-Signalsequenz von HybA besteht, konnte gezeigt werden, dass Tat-Substrate am Ribosom wie andere sekretorische Proteine an Trigger Faktor, ein am Ribosom lokalisiertes Chaperon, binden. Dabei konnte eine Interaktion von Trigger Faktor mit der Tat-Signalsequenz gezeigt werden. Eine cotranslationale Interaktion mit Tat-spezifischen Faktoren wurde nicht beobachtet. Nach vollständiger Synthese interagierte pSufI über die Signalsequenz mit einem 30 kDa großen Protein. 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Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Tat-Transport in den beiden Organismen Rhodobacter capsulatus und Escherichia coli untersucht. Zuerst wurde durch eine erfolgreiche Komplementation einer E. coli ΔtatABCDE-Mutante nachgewiesen, dass die R. capsulatus Tat-Proteine, die zu ca. 29 % zu den E. coli Proteinen TatA, TatB und TatC homolog sind, tatsächlich funktionell sind. Der Funktionsnachweis im in vitro-System gelang dagegen nicht.
In einem weiteren Teil der Arbeit wurde die Energetisierung des Tat-Mechanismus untersucht. Durch hohe Konzentrationen KAc konnte die Translokation des Modellproteins pSufI in die Membranvesikel, die die E. coli Tat-Proteine tragen, signifikant erhöht werden. Dies war durch die Erhöhung des pH-Gradient bedingt. Durch Verwendung des K+/H+-Ionophors Nigericin wurde dieses Ergebnis bestätigt. Da durch das K+-Ionophor Valinomycin die Translokation von pSufI verringert wurde, wurde die Abhängigkeit vom elektrochemischen Membranpotential gezeigt.
Mit Hilfe eines chemischen und eines photoaktivierbaren, ortspezifischen Quervernetzers wurden einzelne Stadien des Tat-Targetings untersucht. Durch den Vergleich von in vitro syntethisierten Ribosomen-assoziierten naszierenden Ketten des Tat-abhängigen pSufI, des Sec-abhängigen pOmpA und des Fusionsproteins HybOmpA, das aus dem reifen Teil von OmpA und der Tat-Signalsequenz von HybA besteht, konnte gezeigt werden, dass Tat-Substrate am Ribosom wie andere sekretorische Proteine an Trigger Faktor, ein am Ribosom lokalisiertes Chaperon, binden. Dabei konnte eine Interaktion von Trigger Faktor mit der Tat-Signalsequenz gezeigt werden. Eine cotranslationale Interaktion mit Tat-spezifischen Faktoren wurde nicht beobachtet. Nach vollständiger Synthese interagierte pSufI über die Signalsequenz mit einem 30 kDa großen Protein. Diese Bindung wurde nur in Abwesenheit von Vesikeln beobachtet, so dass es sich wahrscheinlich um einen Tat-spezifischen Targetingfaktor handelt. Es gelang bisher weder über in vitro noch in vivo Studien diesen Faktor zu identifizieren.","After synthesis in the cytoplasm proteins must be guided to their final destination. Folded and cofactor-containing proteins are translocated via the Tat (Twin arginine translocation) protein transport system. The distinguishing feature of Tat-dependend proteins is the twin arginine containing S-R-R-x-F-L-K consensus motif. The Tat translocon of E. coli is formed by the TatA, TatB and TatC proteins. So far there is little known about this transport mechanism.
In this thesis the transport via the Tat pathway was investigated in the two organisms Rhodobacter capsulatus and Escherichia coli. First it could be shown that the R. capsulatus Tat proteins could functionally complement the E. coli ΔtatABCDE mutant. The homology of the R. Capsulatus to the E. coli TatA, TatB and TatC proteins is about 29 %.
A further aspect to analyse was the source that provided the energy for the translocation by the Tat pathway. The in vitro translocation of the model protein pSufI into innermembrane vesicles (INV) containing the the E. coli Tat proteins could be stimulated by the addition of KAc. This effect is based on the increase of the delta pH. The use of the K+/H+ ionophor nigericin confirmed this finding. The dependency on the electrochemical membrane potential was shown by the decrease of the rate of translocation by the K+ ionophor valinomycin.
With the aid of a chemical and a site-directed, photoactivated crosslinker different phases of the Tat targeting were investigated in detail by analysing ribosome associated nascent chains. The Sec dependent protein pOmpA, HypOmpA, a fusion of the Tat signal sequence of HybA and the mature part of OmpA, and the Tat dependent pSufI were compared. Tat dependent proteins as well as other secretory proteins were recognised by the chaperon Trigger Factor at the ribosome. There were no Tat specific cotranslational interactions. After complete synthesis the signal sequence of pSufI interacts with a 30 kD protein. The interaction was just observed in the absence of INV leading to the conclusion that it is a Tat specific targeting event. Until now it was not possible to identify this factor by in vitro and in vivo approaches."]},{"key":"dc:format.medium","label":"Dc Format Medium","values":["application/pdf"]},{"key":"dc:title","label":"Title","values":["Der Proteintransport in Rhodobacter capsulatus und Escherichia coli über das Tat-Transportsystem","Proteintransport in Rhodobacter capsulatus and Escherichia coli via the Tat Pathway"]}]}],"canonical_facts":{"dc:contributor":["Müller, Matthias"],"dc:creator":["Lüke, Iris"],"dc:description.abstract":["Einige Proteine müssen nach ihrer Synthese im Cytoplasma an ihre Bestimmungsorte transportiert werden. Im gefalteten und cofaktortragenden Zustand werden sie posttranslational über den Tat-Weg (twin arginine translocation) in das Periplasma transloziert. Charakteristisch für die Tat-Substrate ist das Doppelarginin-haltige S-R-R-x-F-L-K-Konsensusmotiv in der Signalsequenz. Das Tat-Translokon wird in E. coli von den Membranproteinen TatA, TatB- und TatC gebildet. Über den Transport-Mechanismus ist bislang wenig bekannt.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Tat-Transport in den beiden Organismen Rhodobacter capsulatus und Escherichia coli untersucht. Zuerst wurde durch eine erfolgreiche Komplementation einer E. coli ΔtatABCDE-Mutante nachgewiesen, dass die R. capsulatus Tat-Proteine, die zu ca. 29 % zu den E. coli Proteinen TatA, TatB und TatC homolog sind, tatsächlich funktionell sind. Der Funktionsnachweis im in vitro-System gelang dagegen nicht.
In einem weiteren Teil der Arbeit wurde die Energetisierung des Tat-Mechanismus untersucht. Durch hohe Konzentrationen KAc konnte die Translokation des Modellproteins pSufI in die Membranvesikel, die die E. coli Tat-Proteine tragen, signifikant erhöht werden. Dies war durch die Erhöhung des pH-Gradient bedingt. Durch Verwendung des K+/H+-Ionophors Nigericin wurde dieses Ergebnis bestätigt. Da durch das K+-Ionophor Valinomycin die Translokation von pSufI verringert wurde, wurde die Abhängigkeit vom elektrochemischen Membranpotential gezeigt.
Mit Hilfe eines chemischen und eines photoaktivierbaren, ortspezifischen Quervernetzers wurden einzelne Stadien des Tat-Targetings untersucht. Durch den Vergleich von in vitro syntethisierten Ribosomen-assoziierten naszierenden Ketten des Tat-abhängigen pSufI, des Sec-abhängigen pOmpA und des Fusionsproteins HybOmpA, das aus dem reifen Teil von OmpA und der Tat-Signalsequenz von HybA besteht, konnte gezeigt werden, dass Tat-Substrate am Ribosom wie andere sekretorische Proteine an Trigger Faktor, ein am Ribosom lokalisiertes Chaperon, binden. Dabei konnte eine Interaktion von Trigger Faktor mit der Tat-Signalsequenz gezeigt werden. Eine cotranslationale Interaktion mit Tat-spezifischen Faktoren wurde nicht beobachtet. Nach vollständiger Synthese interagierte pSufI über die Signalsequenz mit einem 30 kDa großen Protein. Diese Bindung wurde nur in Abwesenheit von Vesikeln beobachtet, so dass es sich wahrscheinlich um einen Tat-spezifischen Targetingfaktor handelt. Es gelang bisher weder über in vitro noch in vivo Studien diesen Faktor zu identifizieren.","After synthesis in the cytoplasm proteins must be guided to their final destination. Folded and cofactor-containing proteins are translocated via the Tat (Twin arginine translocation) protein transport system. The distinguishing feature of Tat-dependend proteins is the twin arginine containing S-R-R-x-F-L-K consensus motif. The Tat translocon of E. coli is formed by the TatA, TatB and TatC proteins. So far there is little known about this transport mechanism.
In this thesis the transport via the Tat pathway was investigated in the two organisms Rhodobacter capsulatus and Escherichia coli. First it could be shown that the R. capsulatus Tat proteins could functionally complement the E. coli ΔtatABCDE mutant. The homology of the R. Capsulatus to the E. coli TatA, TatB and TatC proteins is about 29 %.
A further aspect to analyse was the source that provided the energy for the translocation by the Tat pathway. The in vitro translocation of the model protein pSufI into innermembrane vesicles (INV) containing the the E. coli Tat proteins could be stimulated by the addition of KAc. This effect is based on the increase of the delta pH. The use of the K+/H+ ionophor nigericin confirmed this finding. The dependency on the electrochemical membrane potential was shown by the decrease of the rate of translocation by the K+ ionophor valinomycin.
With the aid of a chemical and a site-directed, photoactivated crosslinker different phases of the Tat targeting were investigated in detail by analysing ribosome associated nascent chains. The Sec dependent protein pOmpA, HypOmpA, a fusion of the Tat signal sequence of HybA and the mature part of OmpA, and the Tat dependent pSufI were compared. Tat dependent proteins as well as other secretory proteins were recognised by the chaperon Trigger Factor at the ribosome. There were no Tat specific cotranslational interactions. After complete synthesis the signal sequence of pSufI interacts with a 30 kD protein. The interaction was just observed in the absence of INV leading to the conclusion that it is a Tat specific targeting event. Until now it was not possible to identify this factor by in vitro and in vivo approaches."],"dc:format.medium":["application/pdf"],"dc:subject":["Tat","proteintranslocation"],"dc:title":["Der Proteintransport in Rhodobacter capsulatus und Escherichia coli über das Tat-Transportsystem","Proteintransport in Rhodobacter capsulatus and Escherichia coli via the Tat Pathway"],"dc:type":["DoctoralThesis"]},"updated_at":"2026-07-24T02:22:16Z"}