Untersuchung des lichtgetriebenen Chloridtransports in Halorhodopsin aus Natronobacterium pharaonis mit statischer und zeitaufgelöster FTIR-Spektroskopie

Bacteriorhodopsine, als Protonenpumpen, und Halorhodopsine, als Chloridpumpen, bilden eine einzigartige Klasse an Licht-Energie-Transduktions-Systemen. Sie dienen bioenergetischen Funktionen, die in anderen Organismen normalerweise durch Redox-Reaktionen oder von einer auf Chlorophyll basierenden Photosynthese gesteuert werden. Diese bakteriellen Ionenpumpen stellen daher ein vereinfachtes aktives Transportsystem basierend auf licht-induzierter Isomerisierung des Retinal-Chromophors dar. Diesem molekularen "Schalter" folgt eine Reihe von Konformationsänderungen im Protein, die einen Ionentransport ermöglichen. <br> <br>Mit Hilfe von unterschiedlichen spektroskopischen Methoden (von UV-Vis, über statische IR-Spektroskopie, sowohl Tieftemperatur wie ATR, bis hin zur zeitaufgelösten Step-Scan-Technik) wurde die lichtgetriebene Chloridpumpe Halorhodopsin aus dem extrem halophilen Archaeabakterium Natronobacterium pharaonis (pHR) näher untersucht. <br>Das Hauptaugenmerk richtete sich auf die Anionenbindungsstelle und damit verbunden, auf die späten Intermediate des Photozyklus von pHR. <br> <br>Im ersten Teil der Arbeit wurde der Schwerpunkt auf statische Untersuchungen im IR mit der ATR-Technik gesetzt. Unterstützt wurde die Untersuchung an verschiedenen Halogeniden (Chlorid, Bromid und Jodid) von Tieftemperaturmessungen an pHR bei 193 K. Aus den erhaltenen Differenzspektren, sowohl mit Kryostat wie mit ATR (in denen zum anionenfreiem pHR, pHRblau, eine definierte Endkonzentration eines Anions zugegeben wurde), ging hervor, dass sich alle drei Halogenide sowohl in den Bindungsspektren wie in dem stabilisiertem pHR-L-Intermediat praktisch identisch verhalten. <br> <br>Bindungsspektren mit ATR wurden auch an Azid, Nitrat und gelabeltem Nitrat durchgeführt. Mit Hilfe von letzterem konnte, trotz der hohen IR-Aktivität von Nitrat, diesem nur eine sehr kleine charakteristische Bande im proteingebundenen Zustand zugeordnet werden. <br>Azid wird von pHR nicht transportiert, wies jedoch überraschende gemeinsame Merkmale mit Nitrat auf. <br> <br>In der zweiten Hälfte der Arbeit wurden die statischen Ergebnisse mit zeitaufgelösten Untersuchungen an pHR (auch aus früheren Messungen) verglichen. Eine deutliche Ähnlichkeit zwischen dem O-Intermediat des pHR Photozyklus und pHRblau zeigte, dass der Übergang von O nach HR, d.h. zum chloridhaltigem Dunkelgrundzustand, nichts anderes widerspiegelt als die Chloridbindung. Dies bestätigte das vorher erarbeitete Photozyklus-Modell von pHR mit einer Chloridabgabe vor dem O-Intermediat und einer Wiederaufnahme von diesem im nachfolgendem Schritt. <br> <br>Step-Scan-Messungen wurden in dieser Arbeit hauptsächlich an der blauen Form durchgeführt, die dank sogenannter Sandwichproben die Stabilisierung dieser Form erlaubte. Zwei Intermediate gingen daraus hervor, die ebenfalls einem Vergleich mit dem chloridhaltigen zeitaufgelösten pHR-Photozyklus unterzogen wurden.

Author dc:creator

• Guijarro Reznickova, Jarmila

Contributors dc:contributor

• Gräber, Peter

• Photozyklus
• ATR
• Step-scan
• Halorhodopsin
• FTIR-Spectroscopy
• Photocycle

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