{"id":{"repo_id":"freiburg-diss","oai_identifier":"oai:freidok.uni-freiburg.de:1390"},"canonical_url":"https://search.dev.ndltd.org/etd/freiburg-diss/oai:freidok.uni-freiburg.de:1390","repository":{"repo_id":"freiburg-diss","name":"University of Freiburg","base_url":"https://freidok.uni-freiburg.de/oai/oai2.php"},"display":{"title":"Untersuchung des lichtgetriebenen Chloridtransports in Halorhodopsin aus Natronobacterium pharaonis mit statischer und zeitaufgelöster FTIR-Spektroskopie","abstract":"Bacteriorhodopsine, als Protonenpumpen, und Halorhodopsine, als Chloridpumpen, bilden eine einzigartige Klasse an Licht-Energie-Transduktions-Systemen. Sie dienen bioenergetischen Funktionen, die in anderen Organismen normalerweise durch Redox-Reaktionen oder von einer auf Chlorophyll basierenden Photosynthese gesteuert werden. Diese bakteriellen Ionenpumpen stellen daher ein vereinfachtes aktives Transportsystem basierend auf licht-induzierter Isomerisierung des Retinal-Chromophors dar. Diesem molekularen \"Schalter\" folgt eine Reihe von Konformationsänderungen im Protein, die einen Ionentransport ermöglichen.
Mit Hilfe von unterschiedlichen spektroskopischen Methoden (von UV-Vis, über statische IR-Spektroskopie, sowohl Tieftemperatur wie ATR, bis hin zur zeitaufgelösten Step-Scan-Technik) wurde die lichtgetriebene Chloridpumpe Halorhodopsin aus dem extrem halophilen Archaeabakterium Natronobacterium pharaonis (pHR) näher untersucht.
Das Hauptaugenmerk richtete sich auf die Anionenbindungsstelle und damit verbunden, auf die späten Intermediate des Photozyklus von pHR.
Im ersten Teil der Arbeit wurde der Schwerpunkt auf statische Untersuchungen im IR mit der ATR-Technik gesetzt. Unterstützt wurde die Untersuchung an verschiedenen Halogeniden (Chlorid, Bromid und Jodid) von Tieftemperaturmessungen an pHR bei 193 K. Aus den erhaltenen Differenzspektren, sowohl mit Kryostat wie mit ATR (in denen zum anionenfreiem pHR, pHRblau, eine definierte Endkonzentration eines Anions zugegeben wurde), ging hervor, dass sich alle drei Halogenide sowohl in den Bindungsspektren wie in dem stabilisiertem pHR-L-Intermediat praktisch identisch verhalten.
Bindungsspektren mit ATR wurden auch an Azid, Nitrat und gelabeltem Nitrat durchgeführt. Mit Hilfe von letzterem konnte, trotz der hohen IR-Aktivität von Nitrat, diesem nur eine sehr kleine charakteristische Bande im proteingebundenen Zustand zugeordnet werden.
Azid wird von pHR nicht transportiert, wies jedoch überraschende gemeinsame Merkmale mit Nitrat auf.
In der zweiten Hälfte der Arbeit wurden die statischen Ergebnisse mit zeitaufgelösten Untersuchungen an pHR (auch aus früheren Messungen) verglichen. Eine deutliche Ähnlichkeit zwischen dem O-Intermediat des pHR Photozyklus und pHRblau zeigte, dass der Übergang von O nach HR, d.h. zum chloridhaltigem Dunkelgrundzustand, nichts anderes widerspiegelt als die Chloridbindung. Dies bestätigte das vorher erarbeitete Photozyklus-Modell von pHR mit einer Chloridabgabe vor dem O-Intermediat und einer Wiederaufnahme von diesem im nachfolgendem Schritt.
Step-Scan-Messungen wurden in dieser Arbeit hauptsächlich an der blauen Form durchgeführt, die dank sogenannter Sandwichproben die Stabilisierung dieser Form erlaubte. Zwei Intermediate gingen daraus hervor, die ebenfalls einem Vergleich mit dem chloridhaltigen zeitaufgelösten pHR-Photozyklus unterzogen wurden.","abstract_html":"Bacteriorhodopsine, als Protonenpumpen, und Halorhodopsine, als Chloridpumpen, bilden eine einzigartige Klasse an Licht-Energie-Transduktions-Systemen. Sie dienen bioenergetischen Funktionen, die in anderen Organismen normalerweise durch Redox-Reaktionen oder von einer auf Chlorophyll basierenden Photosynthese gesteuert werden. Diese bakteriellen Ionenpumpen stellen daher ein vereinfachtes aktives Transportsystem basierend auf licht-induzierter Isomerisierung des Retinal-Chromophors dar. Diesem molekularen "Schalter" folgt eine Reihe von Konformationsänderungen im Protein, die einen Ionentransport ermöglichen. <br> <br>Mit Hilfe von unterschiedlichen spektroskopischen Methoden (von UV-Vis, über statische IR-Spektroskopie, sowohl Tieftemperatur wie ATR, bis hin zur zeitaufgelösten Step-Scan-Technik) wurde die lichtgetriebene Chloridpumpe Halorhodopsin aus dem extrem halophilen Archaeabakterium Natronobacterium pharaonis (pHR) näher untersucht. <br>Das Hauptaugenmerk richtete sich auf die Anionenbindungsstelle und damit verbunden, auf die späten Intermediate des Photozyklus von pHR. <br> <br>Im ersten Teil der Arbeit wurde der Schwerpunkt auf statische Untersuchungen im IR mit der ATR-Technik gesetzt. Unterstützt wurde die Untersuchung an verschiedenen Halogeniden (Chlorid, Bromid und Jodid) von Tieftemperaturmessungen an pHR bei 193 K. 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Mit Hilfe von unterschiedlichen spektroskopischen Methoden (von UV-Vis, über statische IR-Spektroskopie, sowohl Tieftemperatur wie ATR, bis hin zur zeitaufgelösten Step-Scan-Technik) wurde die lichtgetriebene Chloridpumpe Halorhodopsin aus dem extrem halophilen Archaeabakterium Natronobacterium pharaonis (pHR) näher untersucht.
Das Hauptaugenmerk richtete sich auf die Anionenbindungsstelle und damit verbunden, auf die späten Intermediate des Photozyklus von pHR.
Im ersten Teil der Arbeit wurde der Schwerpunkt auf statische Untersuchungen im IR mit der ATR-Technik gesetzt. Unterstützt wurde die Untersuchung an verschiedenen Halogeniden (Chlorid, Bromid und Jodid) von Tieftemperaturmessungen an pHR bei 193 K. Aus den erhaltenen Differenzspektren, sowohl mit Kryostat wie mit ATR (in denen zum anionenfreiem pHR, pHRblau, eine definierte Endkonzentration eines Anions zugegeben wurde), ging hervor, dass sich alle drei Halogenide sowohl in den Bindungsspektren wie in dem stabilisiertem pHR-L-Intermediat praktisch identisch verhalten.
Bindungsspektren mit ATR wurden auch an Azid, Nitrat und gelabeltem Nitrat durchgeführt. Mit Hilfe von letzterem konnte, trotz der hohen IR-Aktivität von Nitrat, diesem nur eine sehr kleine charakteristische Bande im proteingebundenen Zustand zugeordnet werden.
Azid wird von pHR nicht transportiert, wies jedoch überraschende gemeinsame Merkmale mit Nitrat auf.
In der zweiten Hälfte der Arbeit wurden die statischen Ergebnisse mit zeitaufgelösten Untersuchungen an pHR (auch aus früheren Messungen) verglichen. Eine deutliche Ähnlichkeit zwischen dem O-Intermediat des pHR Photozyklus und pHRblau zeigte, dass der Übergang von O nach HR, d.h. zum chloridhaltigem Dunkelgrundzustand, nichts anderes widerspiegelt als die Chloridbindung. Dies bestätigte das vorher erarbeitete Photozyklus-Modell von pHR mit einer Chloridabgabe vor dem O-Intermediat und einer Wiederaufnahme von diesem im nachfolgendem Schritt.
Step-Scan-Messungen wurden in dieser Arbeit hauptsächlich an der blauen Form durchgeführt, die dank sogenannter Sandwichproben die Stabilisierung dieser Form erlaubte. Zwei Intermediate gingen daraus hervor, die ebenfalls einem Vergleich mit dem chloridhaltigen zeitaufgelösten pHR-Photozyklus unterzogen wurden.","Bacteriorhodopsins, as Protonpumps, and Halorhodopsins, as chloride pumps, form a unique class of light-energy transductions systems. They serve bioenergetic functions, that in other organisms where ruled by redox-reactions or by a chlorophyll-based photosynthesis. These bacteria ionpumps constitute therefore a simplified active transport system with a light-induced isomerization of the retinal chromophor as the main step. This molecular switch is followed by a series of conformational changes in the protein that allow an ion transport.
The light-driven chloride pump Halorhodopsin from the extrem halophilic Archaeabacterium Natronobacterium pharaonis (pHR) was analysed with the help of different spectroscopic methods (from UV-Vis, over static IR-spectroscopy: low temperature as well as ATR, to time-resolved step-scan-technic).
The main focus was settled on the anion binding site and combined to this also the late intermediates of the pHR photocycle.
The first part of the work concentrated on static analysis in the IR-region with the ATR-method. This study on pHR with different halogenides (chloride is not the only pumped anion by pHR) was supported by low-temperature measurements at 193K. The resulted difference spectra (to the anion-free form of pHR, the so called pHRblue a specific amount of anion was added) from ATR as well as low-temperature measurements, showed that chloride, bromide and iodide behave almost identical in this binding spectra.
The same binding experiments were also performed with azide, nitrate and labelled nitrate. Double difference-spectra of the last ones permitted to assign only very small characteristic bands to pHR-bound nitrate.
Azide is not transported by pHR but the spectrum exhibited surprising similar features with the nitrate spectra.
The second part of the work focused on time-resolved experiments (also from earlier works performed in this working group), which were compared with the above static results. A clear resemblance between the last intermediate of the pHR photocycle (O-Intermediate) and the pHRblau was found. This shows that transition from O to the chloride containing groundstate of pHR reflects definitively the chloride binding. This confirms the earlier elaborated photocycle model with a chloride release step before the O-Intermediate and a Chloride uptake after this intermediate.
Step-Scan measurements were performed in this work mainly on pHRblue. This anion free form of pHR could be stabilized thanks to a special kind of probe holder named sandwich-probes. Two intermediates resulted from this experiments, which were also a subject of comparison with the earlier obtained chloride containing photocycle of pHR."]},{"key":"dc:format.medium","label":"Dc Format Medium","values":["application/pdf"]},{"key":"dc:title","label":"Title","values":["Untersuchung des lichtgetriebenen Chloridtransports in Halorhodopsin aus Natronobacterium pharaonis mit statischer und zeitaufgelöster FTIR-Spektroskopie","Investigation of the light-driven chloride transport in Halorhodopsin from Natronobacterium pharaonis with static and time-resolved FTIR-Spectroscopy"]}]}],"canonical_facts":{"dc:contributor":["Gräber, Peter"],"dc:creator":["Guijarro Reznickova, Jarmila"],"dc:description.abstract":["Bacteriorhodopsine, als Protonenpumpen, und Halorhodopsine, als Chloridpumpen, bilden eine einzigartige Klasse an Licht-Energie-Transduktions-Systemen. Sie dienen bioenergetischen Funktionen, die in anderen Organismen normalerweise durch Redox-Reaktionen oder von einer auf Chlorophyll basierenden Photosynthese gesteuert werden. Diese bakteriellen Ionenpumpen stellen daher ein vereinfachtes aktives Transportsystem basierend auf licht-induzierter Isomerisierung des Retinal-Chromophors dar. Diesem molekularen \"Schalter\" folgt eine Reihe von Konformationsänderungen im Protein, die einen Ionentransport ermöglichen.
Mit Hilfe von unterschiedlichen spektroskopischen Methoden (von UV-Vis, über statische IR-Spektroskopie, sowohl Tieftemperatur wie ATR, bis hin zur zeitaufgelösten Step-Scan-Technik) wurde die lichtgetriebene Chloridpumpe Halorhodopsin aus dem extrem halophilen Archaeabakterium Natronobacterium pharaonis (pHR) näher untersucht.
Das Hauptaugenmerk richtete sich auf die Anionenbindungsstelle und damit verbunden, auf die späten Intermediate des Photozyklus von pHR.
Im ersten Teil der Arbeit wurde der Schwerpunkt auf statische Untersuchungen im IR mit der ATR-Technik gesetzt. Unterstützt wurde die Untersuchung an verschiedenen Halogeniden (Chlorid, Bromid und Jodid) von Tieftemperaturmessungen an pHR bei 193 K. Aus den erhaltenen Differenzspektren, sowohl mit Kryostat wie mit ATR (in denen zum anionenfreiem pHR, pHRblau, eine definierte Endkonzentration eines Anions zugegeben wurde), ging hervor, dass sich alle drei Halogenide sowohl in den Bindungsspektren wie in dem stabilisiertem pHR-L-Intermediat praktisch identisch verhalten.
Bindungsspektren mit ATR wurden auch an Azid, Nitrat und gelabeltem Nitrat durchgeführt. Mit Hilfe von letzterem konnte, trotz der hohen IR-Aktivität von Nitrat, diesem nur eine sehr kleine charakteristische Bande im proteingebundenen Zustand zugeordnet werden.
Azid wird von pHR nicht transportiert, wies jedoch überraschende gemeinsame Merkmale mit Nitrat auf.
In der zweiten Hälfte der Arbeit wurden die statischen Ergebnisse mit zeitaufgelösten Untersuchungen an pHR (auch aus früheren Messungen) verglichen. Eine deutliche Ähnlichkeit zwischen dem O-Intermediat des pHR Photozyklus und pHRblau zeigte, dass der Übergang von O nach HR, d.h. zum chloridhaltigem Dunkelgrundzustand, nichts anderes widerspiegelt als die Chloridbindung. Dies bestätigte das vorher erarbeitete Photozyklus-Modell von pHR mit einer Chloridabgabe vor dem O-Intermediat und einer Wiederaufnahme von diesem im nachfolgendem Schritt.
Step-Scan-Messungen wurden in dieser Arbeit hauptsächlich an der blauen Form durchgeführt, die dank sogenannter Sandwichproben die Stabilisierung dieser Form erlaubte. Zwei Intermediate gingen daraus hervor, die ebenfalls einem Vergleich mit dem chloridhaltigen zeitaufgelösten pHR-Photozyklus unterzogen wurden.","Bacteriorhodopsins, as Protonpumps, and Halorhodopsins, as chloride pumps, form a unique class of light-energy transductions systems. They serve bioenergetic functions, that in other organisms where ruled by redox-reactions or by a chlorophyll-based photosynthesis. These bacteria ionpumps constitute therefore a simplified active transport system with a light-induced isomerization of the retinal chromophor as the main step. This molecular switch is followed by a series of conformational changes in the protein that allow an ion transport.
The light-driven chloride pump Halorhodopsin from the extrem halophilic Archaeabacterium Natronobacterium pharaonis (pHR) was analysed with the help of different spectroscopic methods (from UV-Vis, over static IR-spectroscopy: low temperature as well as ATR, to time-resolved step-scan-technic).
The main focus was settled on the anion binding site and combined to this also the late intermediates of the pHR photocycle.
The first part of the work concentrated on static analysis in the IR-region with the ATR-method. This study on pHR with different halogenides (chloride is not the only pumped anion by pHR) was supported by low-temperature measurements at 193K. The resulted difference spectra (to the anion-free form of pHR, the so called pHRblue a specific amount of anion was added) from ATR as well as low-temperature measurements, showed that chloride, bromide and iodide behave almost identical in this binding spectra.
The same binding experiments were also performed with azide, nitrate and labelled nitrate. Double difference-spectra of the last ones permitted to assign only very small characteristic bands to pHR-bound nitrate.
Azide is not transported by pHR but the spectrum exhibited surprising similar features with the nitrate spectra.
The second part of the work focused on time-resolved experiments (also from earlier works performed in this working group), which were compared with the above static results. A clear resemblance between the last intermediate of the pHR photocycle (O-Intermediate) and the pHRblau was found. This shows that transition from O to the chloride containing groundstate of pHR reflects definitively the chloride binding. This confirms the earlier elaborated photocycle model with a chloride release step before the O-Intermediate and a Chloride uptake after this intermediate.
Step-Scan measurements were performed in this work mainly on pHRblue. This anion free form of pHR could be stabilized thanks to a special kind of probe holder named sandwich-probes. Two intermediates resulted from this experiments, which were also a subject of comparison with the earlier obtained chloride containing photocycle of pHR."],"dc:format.medium":["application/pdf"],"dc:subject":["Photozyklus","ATR","Step-scan","Halorhodopsin","FTIR-Spectroscopy","Photocycle"],"dc:title":["Untersuchung des lichtgetriebenen Chloridtransports in Halorhodopsin aus Natronobacterium pharaonis mit statischer und zeitaufgelöster FTIR-Spektroskopie","Investigation of the light-driven chloride transport in Halorhodopsin from Natronobacterium pharaonis with static and time-resolved FTIR-Spectroscopy"],"dc:type":["DoctoralThesis"]},"updated_at":"2026-07-24T02:22:16Z"}