Untersuchungen zum Integrations- und Translokationsmodus des Sec-Translokons in Escherichia coli

Das Sec-Translokon der bakteriellen Innenmembran katalysiert sowohl die Translokation sekretorischer Proteine als auch die Integration von Membranproteinen. Die Translokasefunktion erfordert die vektorielle Oeffnung der Translokationspore zur periplasmatischen Seite hin, waehrend die Integrasefunktion die laterale Oeffnung zur Lipidphase voraussetzt. SecY und SecE sind die fuer beide Funktionen essentiellen Komponenten des bakteriellen Translokons. Fuer die Translokasefunktion rekrutiert das Translokon SecG und bildet die funktionelle Einheit fuer die SecA/SecB-abhaengige Proteintranslokation. Die Assemblierung von Membranproteinen erfordert in Pro- wie in Eukaryoten eine signal recognition particle (SRP) vermittelte Zielsteuerung und die Integrase-Aktivitaet des Translokons. Bakterielle Innenmembranproteine mit ausgedehnten periplasmatischen Domaenen wie das Hybridprotein Momp2 benoetigen eine koordinierte Aktion von SRP und SecA. Fuer den Transport dieser Substrate muss das Translokon demnach als Integrase und als Translokase fungieren. Ziel dieser Arbeit war, das Zusammenspiel beider Translokonfunktionen bei der Biogenese von Momp2 im Detail zu analysieren. <br> <br>Um die beiden Funktionen des Sec-Translokons bei der Biogenese von Momp2 getrennt voneinander untersuchen zu koennen, wurde eine SecY-Mutante, SecY205, verwendet, die keine funktionelle Interaktion mit SecA erlaubt und bei der deswegen selektiv die Translokasefunktion blockiert ist. Momp2 ist ein Typ II (N-Terminus im Zytosol,C-Terminus im Periplasma) Membranprotein von E. coli, welches aus einer einzelnen Transmembrandomaene sowie einer 320 Aminosaeuren langen periplasmatischen Domaene besteht. Ribosomenassoziierte naszierende Momp2-Ketten unterschiedlicher Laenge wurden in einem zellfreien in vitro-System aus E. coli synthetisiert und ihre Zielsteuerung bzw. Bindung an Innenmembranvesikel von E. coli ueber Flotations-Dichtegradientenzentrifugation ermittelt. Hierbei waren kurze sowie laengere Momp2-Ketten fuer ihre Zielsteuerung auf SRP angewiesen. Die Bindung naszierender Momp2-Ketten an die Membranvesikel auch der SecY205-Mutante erwies sich als Alkali-resistent. Dies bedeutet, dass die Transmembrandomaene naszierender Momp2-Ketten in die Lipiddoppelschicht der SecY205-Membranvesikel auch ohne funktionell aktives SecA integriert wurde. <br>Die Translokation der periplasmatischen Domaene von naszierenden Momp2-Ketten in das Lumen der Membranvesikel laesst sich anhand der dabei erworbenen Protease-Resistenz verfolgen. Mithilfe von gereinigtem SecA36, einer SecA-Mutante, die den Translokationsdefekt von SecY205 supprimiert, konnte Folgendes gezeigt werden: <br>SecA ist fuer die Translokation membrangebundener Momp2-Ketten essentiell und kann erst nach Abloesung des Ribosoms mit dem Translokon interagieren. Als Nachweis fuer den erfolgreichen Transport der periplasmatischen Momp2-Domaene diente deren Interaktion mit dem periplasmatischen Chaperon Skp. Diese Interaktion konnte durch chemische Quervernetzung nachgewiesen werden. Da SecA auch fuer die Translokation periplasmatischer Momp2-Domaenen von weniger als 25 Aminosaeuren benoetigt wurde, scheint SecA eine generelle Rolle bei der Oeffnung des Translokationskanals zur periplasmatischen Seite hin zu spielen. Naszierende Momp2-Ketten sind fuer ihre Translokation neben SecA auch auf den Protonengradienten ueber der Vesikelmembran angewiesen. <br>Die Ergebnisse zeigen, dass das Sec-Translokon von E. coli nach SRP-abhaengiger Zielsteuerung von naszierenden Ketten eine laterale Oeffnung fuer die Integration von Transmembrandomaenen in die Lipidphase ermoeglicht. Fuer eine anschliessende vektorielle Oeffnung zur periplasmatischen Seite der Membran muss SecA mit SecY interagieren, was eine vorausgehende Abloesung des Ribosoms erfordert.

Author dc:creator

• Deitermann, Sandra

Contributors dc:contributor

• Müller, Matthias L.

• Membranproteinassemblierung
• Signalerkennungspartikel
• SRP
• SecA
• SecYEG
• Translokation
• Membrane protein assembly
• Signal recognition particle
• bacterial translocase

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