{"id":{"repo_id":"freiburg-diss","oai_identifier":"oai:freidok.uni-freiburg.de:1288"},"canonical_url":"https://search.dev.ndltd.org/etd/freiburg-diss/oai:freidok.uni-freiburg.de:1288","repository":{"repo_id":"freiburg-diss","name":"University of Freiburg","base_url":"https://freidok.uni-freiburg.de/oai/oai2.php"},"display":{"title":"Untersuchungen zum Integrations- und Translokationsmodus des Sec-Translokons in Escherichia coli","abstract":"Das Sec-Translokon der bakteriellen Innenmembran katalysiert sowohl die Translokation sekretorischer Proteine als auch die Integration von Membranproteinen. Die Translokasefunktion erfordert die vektorielle Oeffnung der Translokationspore zur periplasmatischen Seite hin, waehrend die Integrasefunktion die laterale Oeffnung zur Lipidphase voraussetzt. SecY und SecE sind die fuer beide Funktionen essentiellen Komponenten des bakteriellen Translokons. Fuer die Translokasefunktion rekrutiert das Translokon SecG und bildet die funktionelle Einheit fuer die SecA/SecB-abhaengige Proteintranslokation. Die Assemblierung von Membranproteinen erfordert in Pro- wie in Eukaryoten eine signal recognition particle (SRP) vermittelte Zielsteuerung und die Integrase-Aktivitaet des Translokons. Bakterielle Innenmembranproteine mit ausgedehnten periplasmatischen Domaenen wie das Hybridprotein Momp2 benoetigen eine koordinierte Aktion von SRP und SecA. Fuer den Transport dieser Substrate muss das Translokon demnach als Integrase und als Translokase fungieren. Ziel dieser Arbeit war, das Zusammenspiel beider Translokonfunktionen bei der Biogenese von Momp2 im Detail zu analysieren. <br> <br>Um die beiden Funktionen des Sec-Translokons bei der Biogenese von Momp2 getrennt voneinander untersuchen zu koennen, wurde eine SecY-Mutante, SecY205, verwendet, die keine funktionelle Interaktion mit SecA erlaubt und bei der deswegen selektiv die Translokasefunktion blockiert ist. Momp2 ist ein Typ II (N-Terminus im Zytosol,C-Terminus im Periplasma) Membranprotein von E. coli, welches aus einer einzelnen Transmembrandomaene sowie einer 320 Aminosaeuren langen periplasmatischen Domaene besteht. Ribosomenassoziierte naszierende Momp2-Ketten unterschiedlicher Laenge wurden in einem zellfreien in vitro-System aus E. coli synthetisiert und ihre Zielsteuerung bzw. Bindung an Innenmembranvesikel von E. coli ueber Flotations-Dichtegradientenzentrifugation ermittelt. Hierbei waren kurze sowie laengere Momp2-Ketten fuer ihre Zielsteuerung auf SRP angewiesen. Die Bindung naszierender Momp2-Ketten an die Membranvesikel auch der SecY205-Mutante erwies sich als Alkali-resistent. Dies bedeutet, dass die Transmembrandomaene naszierender Momp2-Ketten in die Lipiddoppelschicht der SecY205-Membranvesikel auch ohne funktionell aktives SecA integriert wurde. <br>Die Translokation der periplasmatischen Domaene von naszierenden Momp2-Ketten in das Lumen der Membranvesikel laesst sich anhand der dabei erworbenen Protease-Resistenz verfolgen. Mithilfe von gereinigtem SecA36, einer SecA-Mutante, die den Translokationsdefekt von SecY205 supprimiert, konnte Folgendes gezeigt werden: <br>SecA ist fuer die Translokation membrangebundener Momp2-Ketten essentiell und kann erst nach Abloesung des Ribosoms mit dem Translokon interagieren. Als Nachweis fuer den erfolgreichen Transport der periplasmatischen Momp2-Domaene diente deren Interaktion mit dem periplasmatischen Chaperon Skp. Diese Interaktion konnte durch chemische Quervernetzung nachgewiesen werden. Da SecA auch fuer die Translokation periplasmatischer Momp2-Domaenen von weniger als 25 Aminosaeuren benoetigt wurde, scheint SecA eine generelle Rolle bei der Oeffnung des Translokationskanals zur periplasmatischen Seite hin zu spielen. Naszierende Momp2-Ketten sind fuer ihre Translokation neben SecA auch auf den Protonengradienten ueber der Vesikelmembran angewiesen. <br>Die Ergebnisse zeigen, dass das Sec-Translokon von E. coli nach SRP-abhaengiger Zielsteuerung von naszierenden Ketten eine laterale Oeffnung fuer die Integration von Transmembrandomaenen in die Lipidphase ermoeglicht. Fuer eine anschliessende vektorielle Oeffnung zur periplasmatischen Seite der Membran muss SecA mit SecY interagieren, was eine vorausgehende Abloesung des Ribosoms erfordert.","abstract_html":"Das Sec-Translokon der bakteriellen Innenmembran katalysiert sowohl die Translokation sekretorischer Proteine als auch die Integration von Membranproteinen. 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Translocase function requires the vectorial opening of the translocation pore to the periplasmic side of the bacterial membrane, while integrase function depends on lateral opening of the pore to the lipid phase. Both functions require SecY and SecE, as they are the central components of the bacterial translocon. The translocon recruits SecG for translocase function and it provides the basis for SecA/SecB dependent protein translocation across the inner membrane. <br>Membrane protein assembly in both eukaryotes and prokaryotes is mediated by the signal recognition particle (SRP), its receptor, FtsY in bacteria, and the integrase activity of the translocon. The correct topogenesis of membrane proteins with large periplasmic domains, i.e. Momp2, requires the coordinated action of both SRP and SecA. The assembly of these membrane proteins is intricate, as the translocon has to be opened both laterally and vectorially. The aim of this work was to analyze the interplay of both functions of the translocon during the biogenesis of Momp2. <br>Momp2 is a model type II inner membrane protein of E.coli, consisting of a single spanning transmembrane domain followed by a 320 amino acid long periplasmic domain. Both steps, the SRP mediated membrane targeting of Momp2 and the SecA dependent subsequent translocation of the periplasmic loop, can be independently analyzed employing inner membrane vesicles derived from the secY205 mutant strain, as in this mutant the functional interaction of SecA with SecY is impaired. As a result, the translocation of SecA dependent proteins is almost completely blocked, while the integration of SRP dependent but SecA independent membrane proteins is not affected. Ribosome-associated Momp2 nascent chains of different length have been synthesized in a cell-free in vitro system of E.coli. As shown by flotation gradient analysis, membrane targeting of both short and long Momp2 nascent chains required SRP. Furthermore, the targeting step was not impaired by the secY205 mutation. Stable membrane binding was confirmed by alkaline sodium carbonate extraction, suggesting that lipid insertion of the transmembrane domain does not require a functional active SecA. <br>The translocation of the periplasmic loop of Momp2 nascent chains into the lumen of membrane vesicles can be monitored by acquired protease resistance. In order to follow SecA dependent post-targeting events in Momp2 assembly, we made use of the SecA36 mutant protein, which specifically suppresses the secY205 translocation defect. It was shown that SecA is essential for the translocation of membrane bound Momp2 nascent chains. Only after the ribosome is released from the nascent chain, SecA can interact with the translocon. After successful transport of the periplasmic domain of Momp2, the periplasmic chaperone, Skp, was chemical crosslinked to the protein. Since Momp2 nascent chains with periplasmic loops consisting of less than 25 amino acids required SecA for translocation, SecA seems to induce the vectorial opening of the translocation channel for protein transport. Finally, the proton motive force was necessary for the translocation of Momp2 nascent chains. <br>These results demonstrate that the Sec translocon of E.coli allows integration of transmembrane domains into the lipid phase of the membrane by a lateral opening of the translocation pore, after SRP dependent targeting of Momp2 nascent chains. The successive vectorial opening of the translocon to the periplasmic side of the membrane requires a functional interaction of SecA with SecY, and release of the ribosome."]},{"key":"dc:format.medium","label":"Dc Format Medium","values":["application/pdf"]},{"key":"dc:title","label":"Title","values":["Untersuchungen zum Integrations- und Translokationsmodus des Sec-Translokons in Escherichia coli","Investigation of the integration and translocation mode of the Escherichia coli Sec translocon"]}]}],"canonical_facts":{"dc:contributor":["Müller, Matthias L."],"dc:creator":["Deitermann, Sandra"],"dc:description.abstract":["Das Sec-Translokon der bakteriellen Innenmembran katalysiert sowohl die Translokation sekretorischer Proteine als auch die Integration von Membranproteinen. Die Translokasefunktion erfordert die vektorielle Oeffnung der Translokationspore zur periplasmatischen Seite hin, waehrend die Integrasefunktion die laterale Oeffnung zur Lipidphase voraussetzt. 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Ziel dieser Arbeit war, das Zusammenspiel beider Translokonfunktionen bei der Biogenese von Momp2 im Detail zu analysieren. <br> <br>Um die beiden Funktionen des Sec-Translokons bei der Biogenese von Momp2 getrennt voneinander untersuchen zu koennen, wurde eine SecY-Mutante, SecY205, verwendet, die keine funktionelle Interaktion mit SecA erlaubt und bei der deswegen selektiv die Translokasefunktion blockiert ist. Momp2 ist ein Typ II (N-Terminus im Zytosol,C-Terminus im Periplasma) Membranprotein von E. coli, welches aus einer einzelnen Transmembrandomaene sowie einer 320 Aminosaeuren langen periplasmatischen Domaene besteht. Ribosomenassoziierte naszierende Momp2-Ketten unterschiedlicher Laenge wurden in einem zellfreien in vitro-System aus E. coli synthetisiert und ihre Zielsteuerung bzw. Bindung an Innenmembranvesikel von E. coli ueber Flotations-Dichtegradientenzentrifugation ermittelt. Hierbei waren kurze sowie laengere Momp2-Ketten fuer ihre Zielsteuerung auf SRP angewiesen. 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Da SecA auch fuer die Translokation periplasmatischer Momp2-Domaenen von weniger als 25 Aminosaeuren benoetigt wurde, scheint SecA eine generelle Rolle bei der Oeffnung des Translokationskanals zur periplasmatischen Seite hin zu spielen. Naszierende Momp2-Ketten sind fuer ihre Translokation neben SecA auch auf den Protonengradienten ueber der Vesikelmembran angewiesen. <br>Die Ergebnisse zeigen, dass das Sec-Translokon von E. coli nach SRP-abhaengiger Zielsteuerung von naszierenden Ketten eine laterale Oeffnung fuer die Integration von Transmembrandomaenen in die Lipidphase ermoeglicht. Fuer eine anschliessende vektorielle Oeffnung zur periplasmatischen Seite der Membran muss SecA mit SecY interagieren, was eine vorausgehende Abloesung des Ribosoms erfordert.","The Sec translocon of the bacterial inner membrane catalyzes both translocation of secretory proteins and integration of membrane proteins. 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The aim of this work was to analyze the interplay of both functions of the translocon during the biogenesis of Momp2. <br>Momp2 is a model type II inner membrane protein of E.coli, consisting of a single spanning transmembrane domain followed by a 320 amino acid long periplasmic domain. Both steps, the SRP mediated membrane targeting of Momp2 and the SecA dependent subsequent translocation of the periplasmic loop, can be independently analyzed employing inner membrane vesicles derived from the secY205 mutant strain, as in this mutant the functional interaction of SecA with SecY is impaired. As a result, the translocation of SecA dependent proteins is almost completely blocked, while the integration of SRP dependent but SecA independent membrane proteins is not affected. Ribosome-associated Momp2 nascent chains of different length have been synthesized in a cell-free in vitro system of E.coli. As shown by flotation gradient analysis, membrane targeting of both short and long Momp2 nascent chains required SRP. Furthermore, the targeting step was not impaired by the secY205 mutation. Stable membrane binding was confirmed by alkaline sodium carbonate extraction, suggesting that lipid insertion of the transmembrane domain does not require a functional active SecA. <br>The translocation of the periplasmic loop of Momp2 nascent chains into the lumen of membrane vesicles can be monitored by acquired protease resistance. In order to follow SecA dependent post-targeting events in Momp2 assembly, we made use of the SecA36 mutant protein, which specifically suppresses the secY205 translocation defect. It was shown that SecA is essential for the translocation of membrane bound Momp2 nascent chains. Only after the ribosome is released from the nascent chain, SecA can interact with the translocon. After successful transport of the periplasmic domain of Momp2, the periplasmic chaperone, Skp, was chemical crosslinked to the protein. Since Momp2 nascent chains with periplasmic loops consisting of less than 25 amino acids required SecA for translocation, SecA seems to induce the vectorial opening of the translocation channel for protein transport. Finally, the proton motive force was necessary for the translocation of Momp2 nascent chains. <br>These results demonstrate that the Sec translocon of E.coli allows integration of transmembrane domains into the lipid phase of the membrane by a lateral opening of the translocation pore, after SRP dependent targeting of Momp2 nascent chains. 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