Untersuchungen zur Struktur und Wirkung von Pasteurella multocida Toxin

Pasteurella multocida produziert ein 146 kDa Protein (PMT), das eine Vielzahl von zellulären Signaltransduktionswegen aktivieren kann. PMT ist ein starkes Mitogen, und führt zu vermehrter DNA-Synthese und Proliferation. Am besten untersucht ist die Aktivierung von Gaq durch PMT, die zu einer Stimulation der Phospholipase Cb, zur Mobilisierung von Calcium und zur Bildung von Diacylglycerol führt. <br>In der vorliegenden Arbeit sollte erstens die Domänenstruktur von PMT untersucht werden. Von besonderem Interesse war die Klärung der Lokalisation der biologisch aktiven Domäne, die bisher widersprüchlich diskutiert wurde. Des weiteren sollten die molekularen Grundlagen erarbeitet werden, die die erstaunliche Spezifität von PMT, zwischen Gaq und dem eng verwandten Ga11 funktionell zu unterscheiden, erklären könnten. <br>Das PMT-Gen wurde zunächst in den Expressionsvektor pGEX-2TGL kloniert und in E. coli exprimiert. Anschließend wurde das GST-Fusionsprotein über Glutathion-Sepharose-Beads gereinigt und durch Thrombin gespalten. Das rekombinant hergestellte Toxin war aktiv und führte in EBL-Zellen durch Aktivierung der Phospholipase Cb zu einer starken Erhöhung der Inositolphosphatproduktion. Weiterhin induzierte PMT morphologischen Veränderungen, die durch eine Abrundung der Zielzellen und eine Umverteilung des Aktinzytoskeletts charakterisiert waren. <br>Um die Lokalisation der katalytischen Domäne zu klären, wurden verschiedene Bereiche des PMT-Gens deletiert, die Proteine exprimiert und in der Zellkultur auf ihre Aktivität getestet. Da die verkürzten Proteine teilweise nicht mehr in der Lage waren in Zellen einzudringen, wurde die Elektroporation von EBL-Zellen etabliert. In den behandelten Zellen wurde anschließend die Inositolphosphat-Akkumulation gemessen. Untersuchungen mit verschiedenen Deletionen zeigten, dass die aktive Domäne von PMT C-terminal lokalisiert ist. Die Deletion der N-terminalen 580 Aminosäuren (PMT581C) hatte keinen Einfluss auf die Aktivität von PMT, wenn dieses Protein durch Elektropermeabilisation in Zellen eingebracht wurde. Zugabe von PMT581C zum Zellmedium hatte keine Wirkung, da das Toxin nicht aufgenommen wurde. <br>Weiterhin konnte gezeigt werden, dass Cystein-1165 für die biologische Wirkung des Toxins essentiell ist. Durch Translokation mittels Elektropermeabilisierung des inaktiven PMT.C1165S konnte nachgewiesen werden, dass Cystein-1165 für die biologische Aktivität, nicht aber für die Translokation entscheidend ist. <br>PMT besitzt mehrere Histidine innerhalb des katalytisch wichtigen C-Terminus. Um deren Rolle zu untersuchen, wurde das Histidin-modifizierende Diethylpyrocarbonat (DEPC) genutzt. DEPC inhibierte PMT zeit- und konzentrationsabhängig, wodurch eine essentielle Beteiligung eines oder mehrerer Histidine an der biologischen Aktivität naheliegt. Es wurden acht individuelle Histidin-Leucin- bzw. Histidin-Alanin-Mutanten im C-terminalen Bereich generiert und die Aktivität der resultierenden Proteine durch Messung der PLCb-, Rho- und ERK-Stimulation bestimmt. Die Mutation zweier Histidine in Position 1205 und 1223 führte zur Inaktivierung des PMT-Proteins. Es wird vermutet dass, sowohl die identifizierten Histidine (His1205 und His1223) als auch Cystein-1165 an einer essentiellen Metallionenbindung beteiligt sind, die für die biologische Aktivität von PMT essentiell ist. Die Hemmung der Aktivität von PMT durch 1,10-Phenanthrolin unterstützt dieses Modell. <br>Die Stimulation der a-Untereinheit von Gaq wurde durch Überexpression eines RGS-Proteins näher untersucht. Das RGS-Protein war in der Lage, die PMT-induzierte Aktivierung von Gaq zu inhibieren. Eine Inaktivierung von Gaq durch Regulation der GTPase-Aktivität ist auch nach Behandlung mit PMT noch möglich. Daher scheidet eine konstitutive Aktivierung des G-Proteins als Wirkungsmechanismus von PMT aus. <br>Die Aktivierung der PLCb durch PMT, die ausschließlich über Gaq aber nicht über dem eng verwandten Ga11 erfolgt, konnte durch Rekonstitution der a-Untereinheiten von Gaq in einem Gaq/11-freien System bestätigt werden. Durch den Einsatz von Chimären und Punktmutanten von Gaq und Ga11 konnte die essentielle Region in Gaq auf die helikale Domäne und speziell die aB-Helix eingegrenzt werden. Die vorliegenden Untersuchungen zeigen damit erstmals, dass die helikale Domäne von Gaq/11-Proteinen eine funktionelle Rolle bei der Signaltransduktion hat und ihr eine essentielle Rolle bei der Aktivierung durch PMT zukommt.

Author dc:creator

• Orth, Joachim

Contributors dc:contributor

• Schubert, Rolf

• PMT
• DEPC
• G alpha q
• G-protein
• Pasteurella multocida

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