{"id":{"repo_id":"freiburg-diss","oai_identifier":"oai:freidok.uni-freiburg.de:1258"},"canonical_url":"https://search.dev.ndltd.org/etd/freiburg-diss/oai:freidok.uni-freiburg.de:1258","repository":{"repo_id":"freiburg-diss","name":"University of Freiburg","base_url":"https://freidok.uni-freiburg.de/oai/oai2.php"},"display":{"title":"Untersuchungen zur Struktur und Wirkung von Pasteurella multocida Toxin","abstract":"Pasteurella multocida produziert ein 146 kDa Protein (PMT), das eine Vielzahl von zellulären Signaltransduktionswegen aktivieren kann. PMT ist ein starkes Mitogen, und führt zu vermehrter DNA-Synthese und Proliferation. Am besten untersucht ist die Aktivierung von Gaq durch PMT, die zu einer Stimulation der Phospholipase Cb, zur Mobilisierung von Calcium und zur Bildung von Diacylglycerol führt.
In der vorliegenden Arbeit sollte erstens die Domänenstruktur von PMT untersucht werden. Von besonderem Interesse war die Klärung der Lokalisation der biologisch aktiven Domäne, die bisher widersprüchlich diskutiert wurde. Des weiteren sollten die molekularen Grundlagen erarbeitet werden, die die erstaunliche Spezifität von PMT, zwischen Gaq und dem eng verwandten Ga11 funktionell zu unterscheiden, erklären könnten.
Das PMT-Gen wurde zunächst in den Expressionsvektor pGEX-2TGL kloniert und in E. coli exprimiert. Anschließend wurde das GST-Fusionsprotein über Glutathion-Sepharose-Beads gereinigt und durch Thrombin gespalten. Das rekombinant hergestellte Toxin war aktiv und führte in EBL-Zellen durch Aktivierung der Phospholipase Cb zu einer starken Erhöhung der Inositolphosphatproduktion. Weiterhin induzierte PMT morphologischen Veränderungen, die durch eine Abrundung der Zielzellen und eine Umverteilung des Aktinzytoskeletts charakterisiert waren.
Um die Lokalisation der katalytischen Domäne zu klären, wurden verschiedene Bereiche des PMT-Gens deletiert, die Proteine exprimiert und in der Zellkultur auf ihre Aktivität getestet. Da die verkürzten Proteine teilweise nicht mehr in der Lage waren in Zellen einzudringen, wurde die Elektroporation von EBL-Zellen etabliert. In den behandelten Zellen wurde anschließend die Inositolphosphat-Akkumulation gemessen. Untersuchungen mit verschiedenen Deletionen zeigten, dass die aktive Domäne von PMT C-terminal lokalisiert ist. Die Deletion der N-terminalen 580 Aminosäuren (PMT581C) hatte keinen Einfluss auf die Aktivität von PMT, wenn dieses Protein durch Elektropermeabilisation in Zellen eingebracht wurde. Zugabe von PMT581C zum Zellmedium hatte keine Wirkung, da das Toxin nicht aufgenommen wurde.
Weiterhin konnte gezeigt werden, dass Cystein-1165 für die biologische Wirkung des Toxins essentiell ist. Durch Translokation mittels Elektropermeabilisierung des inaktiven PMT.C1165S konnte nachgewiesen werden, dass Cystein-1165 für die biologische Aktivität, nicht aber für die Translokation entscheidend ist.
PMT besitzt mehrere Histidine innerhalb des katalytisch wichtigen C-Terminus. Um deren Rolle zu untersuchen, wurde das Histidin-modifizierende Diethylpyrocarbonat (DEPC) genutzt. DEPC inhibierte PMT zeit- und konzentrationsabhängig, wodurch eine essentielle Beteiligung eines oder mehrerer Histidine an der biologischen Aktivität naheliegt. Es wurden acht individuelle Histidin-Leucin- bzw. Histidin-Alanin-Mutanten im C-terminalen Bereich generiert und die Aktivität der resultierenden Proteine durch Messung der PLCb-, Rho- und ERK-Stimulation bestimmt. Die Mutation zweier Histidine in Position 1205 und 1223 führte zur Inaktivierung des PMT-Proteins. Es wird vermutet dass, sowohl die identifizierten Histidine (His1205 und His1223) als auch Cystein-1165 an einer essentiellen Metallionenbindung beteiligt sind, die für die biologische Aktivität von PMT essentiell ist. Die Hemmung der Aktivität von PMT durch 1,10-Phenanthrolin unterstützt dieses Modell.
Die Stimulation der a-Untereinheit von Gaq wurde durch Überexpression eines RGS-Proteins näher untersucht. Das RGS-Protein war in der Lage, die PMT-induzierte Aktivierung von Gaq zu inhibieren. Eine Inaktivierung von Gaq durch Regulation der GTPase-Aktivität ist auch nach Behandlung mit PMT noch möglich. Daher scheidet eine konstitutive Aktivierung des G-Proteins als Wirkungsmechanismus von PMT aus.
Die Aktivierung der PLCb durch PMT, die ausschließlich über Gaq aber nicht über dem eng verwandten Ga11 erfolgt, konnte durch Rekonstitution der a-Untereinheiten von Gaq in einem Gaq/11-freien System bestätigt werden. Durch den Einsatz von Chimären und Punktmutanten von Gaq und Ga11 konnte die essentielle Region in Gaq auf die helikale Domäne und speziell die aB-Helix eingegrenzt werden. Die vorliegenden Untersuchungen zeigen damit erstmals, dass die helikale Domäne von Gaq/11-Proteinen eine funktionelle Rolle bei der Signaltransduktion hat und ihr eine essentielle Rolle bei der Aktivierung durch PMT zukommt.","abstract_html":"Pasteurella multocida produziert ein 146 kDa Protein (PMT), das eine Vielzahl von zellulären Signaltransduktionswegen aktivieren kann. PMT ist ein starkes Mitogen, und führt zu vermehrter DNA-Synthese und Proliferation. Am besten untersucht ist die Aktivierung von Gaq durch PMT, die zu einer Stimulation der Phospholipase Cb, zur Mobilisierung von Calcium und zur Bildung von Diacylglycerol führt. <br>In der vorliegenden Arbeit sollte erstens die Domänenstruktur von PMT untersucht werden. Von besonderem Interesse war die Klärung der Lokalisation der biologisch aktiven Domäne, die bisher widersprüchlich diskutiert wurde. Des weiteren sollten die molekularen Grundlagen erarbeitet werden, die die erstaunliche Spezifität von PMT, zwischen Gaq und dem eng verwandten Ga11 funktionell zu unterscheiden, erklären könnten. <br>Das PMT-Gen wurde zunächst in den Expressionsvektor pGEX-2TGL kloniert und in E. coli exprimiert. Anschließend wurde das GST-Fusionsprotein über Glutathion-Sepharose-Beads gereinigt und durch Thrombin gespalten. Das rekombinant hergestellte Toxin war aktiv und führte in EBL-Zellen durch Aktivierung der Phospholipase Cb zu einer starken Erhöhung der Inositolphosphatproduktion. Weiterhin induzierte PMT morphologischen Veränderungen, die durch eine Abrundung der Zielzellen und eine Umverteilung des Aktinzytoskeletts charakterisiert waren. <br>Um die Lokalisation der katalytischen Domäne zu klären, wurden verschiedene Bereiche des PMT-Gens deletiert, die Proteine exprimiert und in der Zellkultur auf ihre Aktivität getestet. Da die verkürzten Proteine teilweise nicht mehr in der Lage waren in Zellen einzudringen, wurde die Elektroporation von EBL-Zellen etabliert. In den behandelten Zellen wurde anschließend die Inositolphosphat-Akkumulation gemessen. Untersuchungen mit verschiedenen Deletionen zeigten, dass die aktive Domäne von PMT C-terminal lokalisiert ist. Die Deletion der N-terminalen 580 Aminosäuren (PMT581C) hatte keinen Einfluss auf die Aktivität von PMT, wenn dieses Protein durch Elektropermeabilisation in Zellen eingebracht wurde. Zugabe von PMT581C zum Zellmedium hatte keine Wirkung, da das Toxin nicht aufgenommen wurde. <br>Weiterhin konnte gezeigt werden, dass Cystein-1165 für die biologische Wirkung des Toxins essentiell ist. Durch Translokation mittels Elektropermeabilisierung des inaktiven PMT.C1165S konnte nachgewiesen werden, dass Cystein-1165 für die biologische Aktivität, nicht aber für die Translokation entscheidend ist. <br>PMT besitzt mehrere Histidine innerhalb des katalytisch wichtigen C-Terminus. Um deren Rolle zu untersuchen, wurde das Histidin-modifizierende Diethylpyrocarbonat (DEPC) genutzt. DEPC inhibierte PMT zeit- und konzentrationsabhängig, wodurch eine essentielle Beteiligung eines oder mehrerer Histidine an der biologischen Aktivität naheliegt. Es wurden acht individuelle Histidin-Leucin- bzw. Histidin-Alanin-Mutanten im C-terminalen Bereich generiert und die Aktivität der resultierenden Proteine durch Messung der PLCb-, Rho- und ERK-Stimulation bestimmt. Die Mutation zweier Histidine in Position 1205 und 1223 führte zur Inaktivierung des PMT-Proteins. Es wird vermutet dass, sowohl die identifizierten Histidine (His1205 und His1223) als auch Cystein-1165 an einer essentiellen Metallionenbindung beteiligt sind, die für die biologische Aktivität von PMT essentiell ist. Die Hemmung der Aktivität von PMT durch 1,10-Phenanthrolin unterstützt dieses Modell. <br>Die Stimulation der a-Untereinheit von Gaq wurde durch Überexpression eines RGS-Proteins näher untersucht. Das RGS-Protein war in der Lage, die PMT-induzierte Aktivierung von Gaq zu inhibieren. Eine Inaktivierung von Gaq durch Regulation der GTPase-Aktivität ist auch nach Behandlung mit PMT noch möglich. Daher scheidet eine konstitutive Aktivierung des G-Proteins als Wirkungsmechanismus von PMT aus. <br>Die Aktivierung der PLCb durch PMT, die ausschließlich über Gaq aber nicht über dem eng verwandten Ga11 erfolgt, konnte durch Rekonstitution der a-Untereinheiten von Gaq in einem Gaq/11-freien System bestätigt werden. Durch den Einsatz von Chimären und Punktmutanten von Gaq und Ga11 konnte die essentielle Region in Gaq auf die helikale Domäne und speziell die aB-Helix eingegrenzt werden. Die vorliegenden Untersuchungen zeigen damit erstmals, dass die helikale Domäne von Gaq/11-Proteinen eine funktionelle Rolle bei der Signaltransduktion hat und ihr eine essentielle Rolle bei der Aktivierung durch PMT zukommt.","abstract_has_math":false,"creators":["Orth, Joachim"],"institution":null,"degree_name":null,"degree_level":null,"degree_discipline":null,"degree_department":null,"school":null,"contributors":["Schubert, Rolf"],"advisors":[],"committee_chairs":[],"committee_members":[],"year":null,"date_issued":"","date_published":null,"updated_at":"2026-07-24T02:22:10Z","subjects":["PMT","DEPC","G alpha q","G-protein","Pasteurella multocida"],"languages":[],"rights":[],"rights_urls":[],"identifier_entries":[]},"links":{"outbound_url":"https://freidok.uni-freiburg.de/data/1258","outbound_label":"Repository record","outbound_source":"source_url"},"metadata_groups":[{"id":"people","label":"People","entries":[{"key":"dc:contributor","label":"Contributor","values":["Schubert, Rolf"]},{"key":"dc:creator","label":"Author","values":["Orth, Joachim"]}]},{"id":"academic_context","label":"Academic Context","entries":[{"key":"dc:type","label":"Dc Type","values":["DoctoralThesis"]}]},{"id":"subjects_keywords","label":"Subjects and Keywords","entries":[{"key":"dc:subject","label":"Dc Subject","values":["PMT","DEPC","G alpha q","G-protein","Pasteurella multocida"]}]},{"id":"additional","label":"Additional Metadata","entries":[{"key":"dc:description.abstract","label":"Abstract","values":["Pasteurella multocida produziert ein 146 kDa Protein (PMT), das eine Vielzahl von zellulären Signaltransduktionswegen aktivieren kann. PMT ist ein starkes Mitogen, und führt zu vermehrter DNA-Synthese und Proliferation. Am besten untersucht ist die Aktivierung von Gaq durch PMT, die zu einer Stimulation der Phospholipase Cb, zur Mobilisierung von Calcium und zur Bildung von Diacylglycerol führt.
In der vorliegenden Arbeit sollte erstens die Domänenstruktur von PMT untersucht werden. Von besonderem Interesse war die Klärung der Lokalisation der biologisch aktiven Domäne, die bisher widersprüchlich diskutiert wurde. Des weiteren sollten die molekularen Grundlagen erarbeitet werden, die die erstaunliche Spezifität von PMT, zwischen Gaq und dem eng verwandten Ga11 funktionell zu unterscheiden, erklären könnten.
Das PMT-Gen wurde zunächst in den Expressionsvektor pGEX-2TGL kloniert und in E. coli exprimiert. Anschließend wurde das GST-Fusionsprotein über Glutathion-Sepharose-Beads gereinigt und durch Thrombin gespalten. Das rekombinant hergestellte Toxin war aktiv und führte in EBL-Zellen durch Aktivierung der Phospholipase Cb zu einer starken Erhöhung der Inositolphosphatproduktion. Weiterhin induzierte PMT morphologischen Veränderungen, die durch eine Abrundung der Zielzellen und eine Umverteilung des Aktinzytoskeletts charakterisiert waren.
Um die Lokalisation der katalytischen Domäne zu klären, wurden verschiedene Bereiche des PMT-Gens deletiert, die Proteine exprimiert und in der Zellkultur auf ihre Aktivität getestet. Da die verkürzten Proteine teilweise nicht mehr in der Lage waren in Zellen einzudringen, wurde die Elektroporation von EBL-Zellen etabliert. In den behandelten Zellen wurde anschließend die Inositolphosphat-Akkumulation gemessen. Untersuchungen mit verschiedenen Deletionen zeigten, dass die aktive Domäne von PMT C-terminal lokalisiert ist. Die Deletion der N-terminalen 580 Aminosäuren (PMT581C) hatte keinen Einfluss auf die Aktivität von PMT, wenn dieses Protein durch Elektropermeabilisation in Zellen eingebracht wurde. Zugabe von PMT581C zum Zellmedium hatte keine Wirkung, da das Toxin nicht aufgenommen wurde.
Weiterhin konnte gezeigt werden, dass Cystein-1165 für die biologische Wirkung des Toxins essentiell ist. Durch Translokation mittels Elektropermeabilisierung des inaktiven PMT.C1165S konnte nachgewiesen werden, dass Cystein-1165 für die biologische Aktivität, nicht aber für die Translokation entscheidend ist.
PMT besitzt mehrere Histidine innerhalb des katalytisch wichtigen C-Terminus. Um deren Rolle zu untersuchen, wurde das Histidin-modifizierende Diethylpyrocarbonat (DEPC) genutzt. DEPC inhibierte PMT zeit- und konzentrationsabhängig, wodurch eine essentielle Beteiligung eines oder mehrerer Histidine an der biologischen Aktivität naheliegt. Es wurden acht individuelle Histidin-Leucin- bzw. Histidin-Alanin-Mutanten im C-terminalen Bereich generiert und die Aktivität der resultierenden Proteine durch Messung der PLCb-, Rho- und ERK-Stimulation bestimmt. Die Mutation zweier Histidine in Position 1205 und 1223 führte zur Inaktivierung des PMT-Proteins. Es wird vermutet dass, sowohl die identifizierten Histidine (His1205 und His1223) als auch Cystein-1165 an einer essentiellen Metallionenbindung beteiligt sind, die für die biologische Aktivität von PMT essentiell ist. Die Hemmung der Aktivität von PMT durch 1,10-Phenanthrolin unterstützt dieses Modell.
Die Stimulation der a-Untereinheit von Gaq wurde durch Überexpression eines RGS-Proteins näher untersucht. Das RGS-Protein war in der Lage, die PMT-induzierte Aktivierung von Gaq zu inhibieren. Eine Inaktivierung von Gaq durch Regulation der GTPase-Aktivität ist auch nach Behandlung mit PMT noch möglich. Daher scheidet eine konstitutive Aktivierung des G-Proteins als Wirkungsmechanismus von PMT aus.
Die Aktivierung der PLCb durch PMT, die ausschließlich über Gaq aber nicht über dem eng verwandten Ga11 erfolgt, konnte durch Rekonstitution der a-Untereinheiten von Gaq in einem Gaq/11-freien System bestätigt werden. Durch den Einsatz von Chimären und Punktmutanten von Gaq und Ga11 konnte die essentielle Region in Gaq auf die helikale Domäne und speziell die aB-Helix eingegrenzt werden. Die vorliegenden Untersuchungen zeigen damit erstmals, dass die helikale Domäne von Gaq/11-Proteinen eine funktionelle Rolle bei der Signaltransduktion hat und ihr eine essentielle Rolle bei der Aktivierung durch PMT zukommt.","The protein toxin of Pasteurella multocida (PMT) activates several signal transduction pathways. PMT is a potent mitogen, leading to DNA-synthesis and proliferation. Well known is the activation of Gaq by PMT leading to stimulation of phospholipase Cb and mobilization of calcium.
First the domain structure of the toxin was studied. A C-terminal fragment encompassing amino acids 581 through 1285 (PMT581C) was constructed, which was inactive towards intact embryonic bovine lung (EBL) cells after addition to culture medium but caused reorganisation of the actin cytoskeleton and rounding up of cells when introduced into the cells by electroporation. As the holotoxin, the toxin fragment PMT581C induced increase in total inositol phosphate levels after cell introduction by electroporation. A C-terminal fragment shorter than PMT581C as well as N-terminal fragments were inactive. Exchange of cysteine-1165 for serine in the holotoxin and in the toxin fragment PMT581C resulted in a complete loss of the ability to increase inositol phosphate levels.
In addition to an essential cysteine residue at position 1165, PMT contains several histidine residues in the catalytically important C-terminal part of the protein. In order to elucidate the role of the histidine residues we treated PMT with the histidine-modifying substance diethyl pyrocarbonate (DEPC). DEPC inhibited PMT in a time- and concentration-dependent manner, suggesting that one or several histidine residues are essential for the biological activity of PMT. In experiments in which PMT was directly delivered into the cytosol of EBL cells by electroporation, we show that DEPC-treatment inhibits the catalytically important histidine residues. Leucine substitutions of eight individual histidine residues in the C-terminal catalytic domain of PMT were constructed, and the effect on the biological activity of PMT was analyzed by determining PLCb, Rho and ERK activation. Substitution of two histidine residues, H1205 and H1223, led to inactivation of the resulting PMT proteins, indicating that H1205 and H1223 play an important role in biological activity of the toxin. The precise function of H1205 and H1223 is not yet known. However, treatment of PMT with the cation chelating substance 1,10-phenantroline led to inactivation of the toxin, indicating that the essential histidine residues and cysteine 1165 might be involved in metal ion binding.
Using Gaq/11-deficient cells, it was shown that the PMT-induced pleiotropic effects are mediated by Gaq but not by the highly related Ga11 protein. We studied the molecular basis of the unique specificity of PMT to distinguish between Gaq and/or Ga11. Infection of Gaq/11-deficient cells with retrovirus, encoding Gaq caused reconstitution of PMT-induced activation of PLCb, whereas Ga11-encoding virus did not reconstitute PMT activity. Chimeras between Gaq and/or Ga11 revealed that a peptide region of Gaq, covering amino acids of the all-helical domain, is essential for the action of PMT to activate phospholipase Cb. The data indicate that the all-helical domain of Gaq is essential for the action of PMT and suggest an essential functional role of this domain in signal transduction via Gq proteins."]},{"key":"dc:format.medium","label":"Dc Format Medium","values":["application/pdf"]},{"key":"dc:title","label":"Title","values":["Untersuchungen zur Struktur und Wirkung von Pasteurella multocida Toxin","Analysis of structure and action of Pasteurella multocida toxin"]}]}],"canonical_facts":{"dc:contributor":["Schubert, Rolf"],"dc:creator":["Orth, Joachim"],"dc:description.abstract":["Pasteurella multocida produziert ein 146 kDa Protein (PMT), das eine Vielzahl von zellulären Signaltransduktionswegen aktivieren kann. PMT ist ein starkes Mitogen, und führt zu vermehrter DNA-Synthese und Proliferation. Am besten untersucht ist die Aktivierung von Gaq durch PMT, die zu einer Stimulation der Phospholipase Cb, zur Mobilisierung von Calcium und zur Bildung von Diacylglycerol führt.
In der vorliegenden Arbeit sollte erstens die Domänenstruktur von PMT untersucht werden. Von besonderem Interesse war die Klärung der Lokalisation der biologisch aktiven Domäne, die bisher widersprüchlich diskutiert wurde. Des weiteren sollten die molekularen Grundlagen erarbeitet werden, die die erstaunliche Spezifität von PMT, zwischen Gaq und dem eng verwandten Ga11 funktionell zu unterscheiden, erklären könnten.
Das PMT-Gen wurde zunächst in den Expressionsvektor pGEX-2TGL kloniert und in E. coli exprimiert. Anschließend wurde das GST-Fusionsprotein über Glutathion-Sepharose-Beads gereinigt und durch Thrombin gespalten. Das rekombinant hergestellte Toxin war aktiv und führte in EBL-Zellen durch Aktivierung der Phospholipase Cb zu einer starken Erhöhung der Inositolphosphatproduktion. Weiterhin induzierte PMT morphologischen Veränderungen, die durch eine Abrundung der Zielzellen und eine Umverteilung des Aktinzytoskeletts charakterisiert waren.
Um die Lokalisation der katalytischen Domäne zu klären, wurden verschiedene Bereiche des PMT-Gens deletiert, die Proteine exprimiert und in der Zellkultur auf ihre Aktivität getestet. Da die verkürzten Proteine teilweise nicht mehr in der Lage waren in Zellen einzudringen, wurde die Elektroporation von EBL-Zellen etabliert. In den behandelten Zellen wurde anschließend die Inositolphosphat-Akkumulation gemessen. Untersuchungen mit verschiedenen Deletionen zeigten, dass die aktive Domäne von PMT C-terminal lokalisiert ist. Die Deletion der N-terminalen 580 Aminosäuren (PMT581C) hatte keinen Einfluss auf die Aktivität von PMT, wenn dieses Protein durch Elektropermeabilisation in Zellen eingebracht wurde. Zugabe von PMT581C zum Zellmedium hatte keine Wirkung, da das Toxin nicht aufgenommen wurde.
Weiterhin konnte gezeigt werden, dass Cystein-1165 für die biologische Wirkung des Toxins essentiell ist. Durch Translokation mittels Elektropermeabilisierung des inaktiven PMT.C1165S konnte nachgewiesen werden, dass Cystein-1165 für die biologische Aktivität, nicht aber für die Translokation entscheidend ist.
PMT besitzt mehrere Histidine innerhalb des katalytisch wichtigen C-Terminus. Um deren Rolle zu untersuchen, wurde das Histidin-modifizierende Diethylpyrocarbonat (DEPC) genutzt. DEPC inhibierte PMT zeit- und konzentrationsabhängig, wodurch eine essentielle Beteiligung eines oder mehrerer Histidine an der biologischen Aktivität naheliegt. Es wurden acht individuelle Histidin-Leucin- bzw. Histidin-Alanin-Mutanten im C-terminalen Bereich generiert und die Aktivität der resultierenden Proteine durch Messung der PLCb-, Rho- und ERK-Stimulation bestimmt. Die Mutation zweier Histidine in Position 1205 und 1223 führte zur Inaktivierung des PMT-Proteins. Es wird vermutet dass, sowohl die identifizierten Histidine (His1205 und His1223) als auch Cystein-1165 an einer essentiellen Metallionenbindung beteiligt sind, die für die biologische Aktivität von PMT essentiell ist. Die Hemmung der Aktivität von PMT durch 1,10-Phenanthrolin unterstützt dieses Modell.
Die Stimulation der a-Untereinheit von Gaq wurde durch Überexpression eines RGS-Proteins näher untersucht. Das RGS-Protein war in der Lage, die PMT-induzierte Aktivierung von Gaq zu inhibieren. Eine Inaktivierung von Gaq durch Regulation der GTPase-Aktivität ist auch nach Behandlung mit PMT noch möglich. Daher scheidet eine konstitutive Aktivierung des G-Proteins als Wirkungsmechanismus von PMT aus.
Die Aktivierung der PLCb durch PMT, die ausschließlich über Gaq aber nicht über dem eng verwandten Ga11 erfolgt, konnte durch Rekonstitution der a-Untereinheiten von Gaq in einem Gaq/11-freien System bestätigt werden. Durch den Einsatz von Chimären und Punktmutanten von Gaq und Ga11 konnte die essentielle Region in Gaq auf die helikale Domäne und speziell die aB-Helix eingegrenzt werden. Die vorliegenden Untersuchungen zeigen damit erstmals, dass die helikale Domäne von Gaq/11-Proteinen eine funktionelle Rolle bei der Signaltransduktion hat und ihr eine essentielle Rolle bei der Aktivierung durch PMT zukommt.","The protein toxin of Pasteurella multocida (PMT) activates several signal transduction pathways. PMT is a potent mitogen, leading to DNA-synthesis and proliferation. Well known is the activation of Gaq by PMT leading to stimulation of phospholipase Cb and mobilization of calcium.
First the domain structure of the toxin was studied. A C-terminal fragment encompassing amino acids 581 through 1285 (PMT581C) was constructed, which was inactive towards intact embryonic bovine lung (EBL) cells after addition to culture medium but caused reorganisation of the actin cytoskeleton and rounding up of cells when introduced into the cells by electroporation. As the holotoxin, the toxin fragment PMT581C induced increase in total inositol phosphate levels after cell introduction by electroporation. A C-terminal fragment shorter than PMT581C as well as N-terminal fragments were inactive. Exchange of cysteine-1165 for serine in the holotoxin and in the toxin fragment PMT581C resulted in a complete loss of the ability to increase inositol phosphate levels.
In addition to an essential cysteine residue at position 1165, PMT contains several histidine residues in the catalytically important C-terminal part of the protein. In order to elucidate the role of the histidine residues we treated PMT with the histidine-modifying substance diethyl pyrocarbonate (DEPC). DEPC inhibited PMT in a time- and concentration-dependent manner, suggesting that one or several histidine residues are essential for the biological activity of PMT. In experiments in which PMT was directly delivered into the cytosol of EBL cells by electroporation, we show that DEPC-treatment inhibits the catalytically important histidine residues. Leucine substitutions of eight individual histidine residues in the C-terminal catalytic domain of PMT were constructed, and the effect on the biological activity of PMT was analyzed by determining PLCb, Rho and ERK activation. Substitution of two histidine residues, H1205 and H1223, led to inactivation of the resulting PMT proteins, indicating that H1205 and H1223 play an important role in biological activity of the toxin. The precise function of H1205 and H1223 is not yet known. However, treatment of PMT with the cation chelating substance 1,10-phenantroline led to inactivation of the toxin, indicating that the essential histidine residues and cysteine 1165 might be involved in metal ion binding.
Using Gaq/11-deficient cells, it was shown that the PMT-induced pleiotropic effects are mediated by Gaq but not by the highly related Ga11 protein. We studied the molecular basis of the unique specificity of PMT to distinguish between Gaq and/or Ga11. Infection of Gaq/11-deficient cells with retrovirus, encoding Gaq caused reconstitution of PMT-induced activation of PLCb, whereas Ga11-encoding virus did not reconstitute PMT activity. Chimeras between Gaq and/or Ga11 revealed that a peptide region of Gaq, covering amino acids of the all-helical domain, is essential for the action of PMT to activate phospholipase Cb. The data indicate that the all-helical domain of Gaq is essential for the action of PMT and suggest an essential functional role of this domain in signal transduction via Gq proteins."],"dc:format.medium":["application/pdf"],"dc:subject":["PMT","DEPC","G alpha q","G-protein","Pasteurella multocida"],"dc:title":["Untersuchungen zur Struktur und Wirkung von Pasteurella multocida Toxin","Analysis of structure and action of Pasteurella multocida toxin"],"dc:type":["DoctoralThesis"]},"updated_at":"2026-07-24T02:22:10Z"}