Der Membranteil von H+-ATPasen : Struktur des CF0 aus Spinatchloroplasten, Funktion des EF0 aus E.coli

F-Typ H+-ATPasen sind essentielle Enzyme des Energiestoffwechsels, die in allen Zellen vorkommen, z.B. in der bakteriellen Plasmamembran (EF0F1), den Thylakoiden der Chloroplasten (CF0F1) oder der inneren Mitochondrienmembran (MF0F1). Sie bestehen aus dem hydrophilen Teil F1 und dem membranintegrierten Teil F0, und haben alle die gleiche Funktion: Eine transmembrane elektrochemische Potentialdifferenz der Protonen liefert die Triebkraft für Protonentransport durch den Membranteil, die dabei freiwerdende Energie wird im F1-Teil zur Synthese von ATP aus ADP und Phosphat genutzt. Während die Struktur des F1-Teils durch Röntgenstrukturanalyse aufgeklärt wurde, war die Struktur des Membranteils zu Beginn dieser Arbeit weitgehend unbekannt. <br>Ziel dieser Arbeit war, Struktur und Funktion des F0–Teils von ATPasen weiter aufzuklären. Dafür wurde zunächst eine neue Isolierungsmethode für den Membranteil CF0 aus Spinatchloroplasten entwickelt, sie lieferte das intakte CF0 mit allen 4 Untereinheiten (UE) I, II, III und IV: Zuerst wurde CF0F1 aus Thylakoidmembranen extrahiert, dann der F1-Teil mit NaSCN denaturiert, schließlich der empfindliche F0-Teil in Anwesenheit eines optimierten Detergens/Lipidgemischs gereinigt, und zwar mit einer Sucrosegradienten-Zentrifugation, gefolgt von einer präparativen Elektroforese. Dabei wurde gleichzeitig auch der Komplex III14 isoliert. Beide Komplexe wurden zweidimensional kristallisiert. Aus III14 wurden 2D-Kristalle in 2 verschiedenen Kristallstrukturen erhalten, aus CF0 nur „Fladen“, große membranähnliche Verbände ohne Fernordnung. Beide wurden nach Negativkontrastierung im Transmissions-Elektronenmikroskop (TEM) und in wässriger Umgebung mit dem Rasterkraftmikroskop (AFM) im contact mode abgebildet. Nur die AFM-Bilder des III14 zeigten genug Kontrast für eine direkte Auswertung, alle anderen wurden einer Bildverarbeitung unterzogen. Nach automatischer Selektion von Bildern einzelner Komplexe, iterativem Ausrichten, Klassifizierung und Multireferenzausrichtung wurden Summenbilder erhalten, die strukturelle Details zeigten. Für III14 wurde im TEM eine Struktur aus 2 konzentrischen Ringen gefunden. Mit dem AFM konnten die alternierend angeordneten Ober- und Unterseiten der Komplexe unterschieden werden. Eine Seite zeigte einen Ring aus 14 abzählbaren Segmenten, jedes einer Kopie der UE III entsprechend; die andere einen etwas kleineren Ring, in dessen Mitte sich eine weitere ringförmige Struktur befand. Mit Hilfe von Rotationspowerspektren wurde auch hier eine 14-zählige Symmetrie gefunden. Damit konnte die Stöchiometrie zu 14 Kopien von UE III pro Komplex bestimmt werden. Der mittlere Durchmesser des Komplexes betrug 6.4 nm. Es wurde ein Modell beschrieben, bei dem die innere Struktur der kleinen Seite den N-Termini der UE III zugeordnet ist. Für CF0 wurden im TEM ähnliche Strukturen gefunden wie für III14, jedoch mit einer zusätzlichen, asymmetrisch angeordneten Proteinmasse, die sich von zwischen den Ringen bis jenseits des äußeren Rings erstreckte. Mit dem AFM wurde ohne Klassifizierung ebenfalls eine doppelte Ringstruktur gefunden, mit einer ähnlichen, sehr prominenten, asymmetrischen Masse, die den UE I, II und/oder IV zuzuordnen ist. Ein Strukturmodell wurde postuliert, bei dem UE IV teilweise innerhalb und außerhalb des Ringes III14 sitzt und fest an den Stator aus UE I und II bindet. Die asymmetrische Masse ist dann der UE IV und insbesondere dem verbrückenden Teil zwischen beiden Domänen zuzuordnen. <br>Untersuchungen zur Funktion des Membranteils EF0 aus E.coli hatten zum Ziel, das Zusammenwirken dreier konservierter Aminosäuren zu untersuchen. Es wird vermutet, dass Protonen durch die Membran entlang einiger für die Funktion essentieller Reste weitergereicht werden. In E.coli sind das u.a. R210 und E219 in UE a und D61 in UE c. Es war gefunden worden, dass die Mutationen E219G und R210A in UE a passive Protonenleitfähigkeit in EF0F1 und/oder EF0 bewirkten. Dies Verhalten war ungewöhnlich, da nicht konservative Mutationen an essentiellen Resten normalerweise die Protonenleitung völlig unterbinden. Um zu überprüfen, ob eine entkoppelte Restleitfähigkeit entlang der mutierten Aminosäuren vorlag, oder ob durch die Mutation eventuell die Assemblierung des Komplexes fehlerhaft erfolgte, wurden beide Mutationen durch Punktmutagenese mit einer neu entwickelten Klonierungsstrategie jeweils mit D61N in UE c zu einer Doppelmutante kombiniert. Die mutierten Enzyme wurden in ATPase-defizienten E.coli-Hintergrundstämmen exprimiert. Es stellte sich heraus, dass auch die Mutation E219G alleine keine Protonenpermeabilität erzeugte, die Daten in der Literatur also fehlerhaft waren. Für EF0F1 und EF0 mit der Mutation R210A wurde in Fluoreszenzlöschungs-Experimenten an den Plasmamembranen passive Protonenleitfähigkeit gefunden. Diese wurde durch die Kombination mit D61N unterbunden. Daraus wird gefolgert, dass D61 in UE c und R210 in UE a direkte Bestandteile des Protonenleitungspfades sind.

Author dc:creator

• Eisfeld, Jochen

Contributors dc:contributor

• Gräber, Peter

• Membranteil CF0
• III14
• Untereinheit III oligomer
• 2D-Kristallisation
• Doppelmutante
• H+-ATPase
• membrane part CFo
• subunit III complex
• atomic force microscopy
• 2D-crystal

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