{"id":{"repo_id":"freiburg-diss","oai_identifier":"oai:freidok.uni-freiburg.de:1242"},"canonical_url":"https://search.dev.ndltd.org/etd/freiburg-diss/oai:freidok.uni-freiburg.de:1242","repository":{"repo_id":"freiburg-diss","name":"University of Freiburg","base_url":"https://freidok.uni-freiburg.de/oai/oai2.php"},"display":{"title":"Der Membranteil von H+-ATPasen : Struktur des CF0 aus Spinatchloroplasten, Funktion des EF0 aus E.coli","abstract":"F-Typ H+-ATPasen sind essentielle Enzyme des Energiestoffwechsels, die in allen Zellen vorkommen, z.B. in der bakteriellen Plasmamembran (EF0F1), den Thylakoiden der Chloroplasten (CF0F1) oder der inneren Mitochondrienmembran (MF0F1). Sie bestehen aus dem hydrophilen Teil F1 und dem membranintegrierten Teil F0, und haben alle die gleiche Funktion: Eine transmembrane elektrochemische Potentialdifferenz der Protonen liefert die Triebkraft für Protonentransport durch den Membranteil, die dabei freiwerdende Energie wird im F1-Teil zur Synthese von ATP aus ADP und Phosphat genutzt. Während die Struktur des F1-Teils durch Röntgenstrukturanalyse aufgeklärt wurde, war die Struktur des Membranteils zu Beginn dieser Arbeit weitgehend unbekannt. <br>Ziel dieser Arbeit war, Struktur und Funktion des F0–Teils von ATPasen weiter aufzuklären. Dafür wurde zunächst eine neue Isolierungsmethode für den Membranteil CF0 aus Spinatchloroplasten entwickelt, sie lieferte das intakte CF0 mit allen 4 Untereinheiten (UE) I, II, III und IV: Zuerst wurde CF0F1 aus Thylakoidmembranen extrahiert, dann der F1-Teil mit NaSCN denaturiert, schließlich der empfindliche F0-Teil in Anwesenheit eines optimierten Detergens/Lipidgemischs gereinigt, und zwar mit einer Sucrosegradienten-Zentrifugation, gefolgt von einer präparativen Elektroforese. Dabei wurde gleichzeitig auch der Komplex III14 isoliert. Beide Komplexe wurden zweidimensional kristallisiert. Aus III14 wurden 2D-Kristalle in 2 verschiedenen Kristallstrukturen erhalten, aus CF0 nur „Fladen“, große membranähnliche Verbände ohne Fernordnung. Beide wurden nach Negativkontrastierung im Transmissions-Elektronenmikroskop (TEM) und in wässriger Umgebung mit dem Rasterkraftmikroskop (AFM) im contact mode abgebildet. Nur die AFM-Bilder des III14 zeigten genug Kontrast für eine direkte Auswertung, alle anderen wurden einer Bildverarbeitung unterzogen. Nach automatischer Selektion von Bildern einzelner Komplexe, iterativem Ausrichten, Klassifizierung und Multireferenzausrichtung wurden Summenbilder erhalten, die strukturelle Details zeigten. Für III14 wurde im TEM eine Struktur aus 2 konzentrischen Ringen gefunden. Mit dem AFM konnten die alternierend angeordneten Ober- und Unterseiten der Komplexe unterschieden werden. Eine Seite zeigte einen Ring aus 14 abzählbaren Segmenten, jedes einer Kopie der UE III entsprechend; die andere einen etwas kleineren Ring, in dessen Mitte sich eine weitere ringförmige Struktur befand. Mit Hilfe von Rotationspowerspektren wurde auch hier eine 14-zählige Symmetrie gefunden. Damit konnte die Stöchiometrie zu 14 Kopien von UE III pro Komplex bestimmt werden. Der mittlere Durchmesser des Komplexes betrug 6.4 nm. Es wurde ein Modell beschrieben, bei dem die innere Struktur der kleinen Seite den N-Termini der UE III zugeordnet ist. Für CF0 wurden im TEM ähnliche Strukturen gefunden wie für III14, jedoch mit einer zusätzlichen, asymmetrisch angeordneten Proteinmasse, die sich von zwischen den Ringen bis jenseits des äußeren Rings erstreckte. Mit dem AFM wurde ohne Klassifizierung ebenfalls eine doppelte Ringstruktur gefunden, mit einer ähnlichen, sehr prominenten, asymmetrischen Masse, die den UE I, II und/oder IV zuzuordnen ist. Ein Strukturmodell wurde postuliert, bei dem UE IV teilweise innerhalb und außerhalb des Ringes III14 sitzt und fest an den Stator aus UE I und II bindet. Die asymmetrische Masse ist dann der UE IV und insbesondere dem verbrückenden Teil zwischen beiden Domänen zuzuordnen. <br>Untersuchungen zur Funktion des Membranteils EF0 aus E.coli hatten zum Ziel, das Zusammenwirken dreier konservierter Aminosäuren zu untersuchen. Es wird vermutet, dass Protonen durch die Membran entlang einiger für die Funktion essentieller Reste weitergereicht werden. In E.coli sind das u.a. R210 und E219 in UE a und D61 in UE c. Es war gefunden worden, dass die Mutationen E219G und R210A in UE a passive Protonenleitfähigkeit in EF0F1 und/oder EF0 bewirkten. Dies Verhalten war ungewöhnlich, da nicht konservative Mutationen an essentiellen Resten normalerweise die Protonenleitung völlig unterbinden. Um zu überprüfen, ob eine entkoppelte Restleitfähigkeit entlang der mutierten Aminosäuren vorlag, oder ob durch die Mutation eventuell die Assemblierung des Komplexes fehlerhaft erfolgte, wurden beide Mutationen durch Punktmutagenese mit einer neu entwickelten Klonierungsstrategie jeweils mit D61N in UE c zu einer Doppelmutante kombiniert. Die mutierten Enzyme wurden in ATPase-defizienten E.coli-Hintergrundstämmen exprimiert. Es stellte sich heraus, dass auch die Mutation E219G alleine keine Protonenpermeabilität erzeugte, die Daten in der Literatur also fehlerhaft waren. Für EF0F1 und EF0 mit der Mutation R210A wurde in Fluoreszenzlöschungs-Experimenten an den Plasmamembranen passive Protonenleitfähigkeit gefunden. Diese wurde durch die Kombination mit D61N unterbunden. Daraus wird gefolgert, dass D61 in UE c und R210 in UE a direkte Bestandteile des Protonenleitungspfades sind.","abstract_html":"F-Typ H+-ATPasen sind essentielle Enzyme des Energiestoffwechsels, die in allen Zellen vorkommen, z.B. in der bakteriellen Plasmamembran (EF0F1), den Thylakoiden der Chloroplasten (CF0F1) oder der inneren Mitochondrienmembran (MF0F1). 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Nur die AFM-Bilder des III14 zeigten genug Kontrast für eine direkte Auswertung, alle anderen wurden einer Bildverarbeitung unterzogen. Nach automatischer Selektion von Bildern einzelner Komplexe, iterativem Ausrichten, Klassifizierung und Multireferenzausrichtung wurden Summenbilder erhalten, die strukturelle Details zeigten. Für III14 wurde im TEM eine Struktur aus 2 konzentrischen Ringen gefunden. Mit dem AFM konnten die alternierend angeordneten Ober- und Unterseiten der Komplexe unterschieden werden. Eine Seite zeigte einen Ring aus 14 abzählbaren Segmenten, jedes einer Kopie der UE III entsprechend; die andere einen etwas kleineren Ring, in dessen Mitte sich eine weitere ringförmige Struktur befand. Mit Hilfe von Rotationspowerspektren wurde auch hier eine 14-zählige Symmetrie gefunden. Damit konnte die Stöchiometrie zu 14 Kopien von UE III pro Komplex bestimmt werden. Der mittlere Durchmesser des Komplexes betrug 6.4 nm. Es wurde ein Modell beschrieben, bei dem die innere Struktur der kleinen Seite den N-Termini der UE III zugeordnet ist. Für CF0 wurden im TEM ähnliche Strukturen gefunden wie für III14, jedoch mit einer zusätzlichen, asymmetrisch angeordneten Proteinmasse, die sich von zwischen den Ringen bis jenseits des äußeren Rings erstreckte. Mit dem AFM wurde ohne Klassifizierung ebenfalls eine doppelte Ringstruktur gefunden, mit einer ähnlichen, sehr prominenten, asymmetrischen Masse, die den UE I, II und/oder IV zuzuordnen ist. Ein Strukturmodell wurde postuliert, bei dem UE IV teilweise innerhalb und außerhalb des Ringes III14 sitzt und fest an den Stator aus UE I und II bindet. Die asymmetrische Masse ist dann der UE IV und insbesondere dem verbrückenden Teil zwischen beiden Domänen zuzuordnen. &lt;br&gt;Untersuchungen zur Funktion des Membranteils EF0 aus E.coli hatten zum Ziel, das Zusammenwirken dreier konservierter Aminosäuren zu untersuchen. Es wird vermutet, dass Protonen durch die Membran entlang einiger für die Funktion essentieller Reste weitergereicht werden. In E.coli sind das u.a. R210 und E219 in UE a und D61 in UE c. Es war gefunden worden, dass die Mutationen E219G und R210A in UE a passive Protonenleitfähigkeit in EF0F1 und/oder EF0 bewirkten. Dies Verhalten war ungewöhnlich, da nicht konservative Mutationen an essentiellen Resten normalerweise die Protonenleitung völlig unterbinden. Um zu überprüfen, ob eine entkoppelte Restleitfähigkeit entlang der mutierten Aminosäuren vorlag, oder ob durch die Mutation eventuell die Assemblierung des Komplexes fehlerhaft erfolgte, wurden beide Mutationen durch Punktmutagenese mit einer neu entwickelten Klonierungsstrategie jeweils mit D61N in UE c zu einer Doppelmutante kombiniert. Die mutierten Enzyme wurden in ATPase-defizienten E.coli-Hintergrundstämmen exprimiert. Es stellte sich heraus, dass auch die Mutation E219G alleine keine Protonenpermeabilität erzeugte, die Daten in der Literatur also fehlerhaft waren. Für EF0F1 und EF0 mit der Mutation R210A wurde in Fluoreszenzlöschungs-Experimenten an den Plasmamembranen passive Protonenleitfähigkeit gefunden. Diese wurde durch die Kombination mit D61N unterbunden. 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Dafür wurde zunächst eine neue Isolierungsmethode für den Membranteil CF0 aus Spinatchloroplasten entwickelt, sie lieferte das intakte CF0 mit allen 4 Untereinheiten (UE) I, II, III und IV: Zuerst wurde CF0F1 aus Thylakoidmembranen extrahiert, dann der F1-Teil mit NaSCN denaturiert, schließlich der empfindliche F0-Teil in Anwesenheit eines optimierten Detergens/Lipidgemischs gereinigt, und zwar mit einer Sucrosegradienten-Zentrifugation, gefolgt von einer präparativen Elektroforese. Dabei wurde gleichzeitig auch der Komplex III14 isoliert. Beide Komplexe wurden zweidimensional kristallisiert. Aus III14 wurden 2D-Kristalle in 2 verschiedenen Kristallstrukturen erhalten, aus CF0 nur „Fladen“, große membranähnliche Verbände ohne Fernordnung. Beide wurden nach Negativkontrastierung im Transmissions-Elektronenmikroskop (TEM) und in wässriger Umgebung mit dem Rasterkraftmikroskop (AFM) im contact mode abgebildet. Nur die AFM-Bilder des III14 zeigten genug Kontrast für eine direkte Auswertung, alle anderen wurden einer Bildverarbeitung unterzogen. Nach automatischer Selektion von Bildern einzelner Komplexe, iterativem Ausrichten, Klassifizierung und Multireferenzausrichtung wurden Summenbilder erhalten, die strukturelle Details zeigten. Für III14 wurde im TEM eine Struktur aus 2 konzentrischen Ringen gefunden. Mit dem AFM konnten die alternierend angeordneten Ober- und Unterseiten der Komplexe unterschieden werden. Eine Seite zeigte einen Ring aus 14 abzählbaren Segmenten, jedes einer Kopie der UE III entsprechend; die andere einen etwas kleineren Ring, in dessen Mitte sich eine weitere ringförmige Struktur befand. Mit Hilfe von Rotationspowerspektren wurde auch hier eine 14-zählige Symmetrie gefunden. Damit konnte die Stöchiometrie zu 14 Kopien von UE III pro Komplex bestimmt werden. Der mittlere Durchmesser des Komplexes betrug 6.4 nm. Es wurde ein Modell beschrieben, bei dem die innere Struktur der kleinen Seite den N-Termini der UE III zugeordnet ist. Für CF0 wurden im TEM ähnliche Strukturen gefunden wie für III14, jedoch mit einer zusätzlichen, asymmetrisch angeordneten Proteinmasse, die sich von zwischen den Ringen bis jenseits des äußeren Rings erstreckte. Mit dem AFM wurde ohne Klassifizierung ebenfalls eine doppelte Ringstruktur gefunden, mit einer ähnlichen, sehr prominenten, asymmetrischen Masse, die den UE I, II und/oder IV zuzuordnen ist. Ein Strukturmodell wurde postuliert, bei dem UE IV teilweise innerhalb und außerhalb des Ringes III14 sitzt und fest an den Stator aus UE I und II bindet. Die asymmetrische Masse ist dann der UE IV und insbesondere dem verbrückenden Teil zwischen beiden Domänen zuzuordnen. <br>Untersuchungen zur Funktion des Membranteils EF0 aus E.coli hatten zum Ziel, das Zusammenwirken dreier konservierter Aminosäuren zu untersuchen. Es wird vermutet, dass Protonen durch die Membran entlang einiger für die Funktion essentieller Reste weitergereicht werden. In E.coli sind das u.a. R210 und E219 in UE a und D61 in UE c. Es war gefunden worden, dass die Mutationen E219G und R210A in UE a passive Protonenleitfähigkeit in EF0F1 und/oder EF0 bewirkten. Dies Verhalten war ungewöhnlich, da nicht konservative Mutationen an essentiellen Resten normalerweise die Protonenleitung völlig unterbinden. Um zu überprüfen, ob eine entkoppelte Restleitfähigkeit entlang der mutierten Aminosäuren vorlag, oder ob durch die Mutation eventuell die Assemblierung des Komplexes fehlerhaft erfolgte, wurden beide Mutationen durch Punktmutagenese mit einer neu entwickelten Klonierungsstrategie jeweils mit D61N in UE c zu einer Doppelmutante kombiniert. Die mutierten Enzyme wurden in ATPase-defizienten E.coli-Hintergrundstämmen exprimiert. Es stellte sich heraus, dass auch die Mutation E219G alleine keine Protonenpermeabilität erzeugte, die Daten in der Literatur also fehlerhaft waren. Für EF0F1 und EF0 mit der Mutation R210A wurde in Fluoreszenzlöschungs-Experimenten an den Plasmamembranen passive Protonenleitfähigkeit gefunden. Diese wurde durch die Kombination mit D61N unterbunden. Daraus wird gefolgert, dass D61 in UE c und R210 in UE a direkte Bestandteile des Protonenleitungspfades sind.","F-type H+-ATPases are essential enzymes of the energy metabolism. They occur in all types of cells, e.g. in bacterial plasma membranes (EF0F1), in chloroplast thylakoids (CF0F1) or in the inner mitochondrial membrane (MF0F1). They consist of the hydrophilic part F1 and the membrane integrated part F0, and they all share the same function: a transmembrane electrochemical potential difference of the protons provides the driving force for a proton transport across the membrane part F0, and the released energy is used in the F1-part for synthesis of ATP from ADP and phosphate. While the structure of the F1-part has been solved by X-ray analysis, the structure of the F0-part was widely unknown when this work was started. <br>The aim of this work was to further elucidate the structure and function of the F0–part of ATPases. First, a new isolation method for the membrane part CF0 from spinach chloroplasts was developed, it yielded the intact CF0 containing all four subunits (SU) I, II, III and IV: CF0F1 was first extracted from thylakoid membranes, then the F1-part was denatured with NaSCN. Finally, the sensitive F0–part was purified, in the presence of an optimized detergent/lipid mixture, via a sucrose gradient centrifugation, followed by a preparative electrophoresis. With this method, the complex III14 could be isolated simultaneously. Both complexes were crystallised two-dimensionally. III14 yielded 2D-crystals in two different crystal structures, while CF0 only yielded arrays, big membrane-like structures without a long-range order. Both were imaged by transmission electron microscopy (TEM) after negative staining and by atomic force microscopy (AFM) in contact mode in aqueous environment. Only the AFM images of III14 showed enough contrast for direct analysis, all others were electronically processed. After automatic selection of single complex images, iterative alignment, classification and multi reference alignment, sum images were generated that showed structural details. For III14 with TEM, a structure of two concentric rings was found. With AFM, the alternatingly arranged upper and lower sides of the complexes could be discerned. One side showed a ring of 14 countable segments, each corresponding to one copy of SU III, the other side showed a slightly smaller ring, inside which a further ring-like structure was found. By calculating rotational power spectra, a 14-fold symmetry could be found here, too. So the stoichiometry could be determined to 14 copies of SU III per complex. The average diameter of the complexes was 6.4 nm. A model was described in which the inner structure of the small side is assigned to the N-termini of SU III. For CF0 with TEM, similar structures were found as for III14, but with an additional protein mass arranged asymmetrically, starting in between the rings crossing the outer ring and extending beyond it. With AFM without classification, a double ring structure was found, too, together with a very prominent, asymmetric mass similar to the one seen in TEM. This protein mass has to be assigned to SU I, II and/or IV. A structure model was proposed, in which SU IV sits partly inside and partly outside of the ring III14 and binds tightly to the stator composed of SU I and II. The asymmetric mass is then assigned to SU IV, in particular to the bridging part between the two domains. <br>Our functional investigations of the membrane part EF0 from E.coli targeted the interaction of three conserved amino acids. It is assumed that protons are being passed on across the membrane along several amino acids that are essential for function. In E.coli, these are R210 and E219 in SU a and D61 in SU c, amongst others. The mutations E219G and R210A in SU a had been found to confer a passive proton conductivity on EF0F1 and/or EF0. This was unusual, as non-conservative mutations in essential amino acids normally abolish proton conductivity completely. To investigate whether there was a decoupled residual conductivity along the mutated amino acids, or whether perhaps the assembly of the complex was faulty due to the mutations, each mutation was combined, via point directed mutagenesis with a newly developed cloning strategy, with D61N in SU c to yield a double mutant. The double mutated enzymes and controls were expressed from plasmids in ATPase-deficient E.coli background strains. The mutation E219G by its own proved to confer no proton permeability on the enzyme, thereby falsifying the published data. For EF0F1 and EF0 with the mutation R210A, there was a passive proton permeability found in fluorescence quench experiments on the plasma membranes. This permeability was abolished by combination with D61N. It was concluded that D61 in SU c and R210 in SU a are direct elements of the proton conducting path."]},{"key":"dc:format.medium","label":"Dc Format Medium","values":["application/pdf"]},{"key":"dc:title","label":"Title","values":["Der Membranteil von H+-ATPasen : Struktur des CF0 aus Spinatchloroplasten, Funktion des EF0 aus E.coli","The membrane part of H+-ATPases : structure of CFo from spinach chloroplasts, function of EFo from E. coli"]}]}],"canonical_facts":{"dc:contributor":["Gräber, Peter"],"dc:creator":["Eisfeld, Jochen"],"dc:description.abstract":["F-Typ H+-ATPasen sind essentielle Enzyme des Energiestoffwechsels, die in allen Zellen vorkommen, z.B. in der bakteriellen Plasmamembran (EF0F1), den Thylakoiden der Chloroplasten (CF0F1) oder der inneren Mitochondrienmembran (MF0F1). Sie bestehen aus dem hydrophilen Teil F1 und dem membranintegrierten Teil F0, und haben alle die gleiche Funktion: Eine transmembrane elektrochemische Potentialdifferenz der Protonen liefert die Triebkraft für Protonentransport durch den Membranteil, die dabei freiwerdende Energie wird im F1-Teil zur Synthese von ATP aus ADP und Phosphat genutzt. Während die Struktur des F1-Teils durch Röntgenstrukturanalyse aufgeklärt wurde, war die Struktur des Membranteils zu Beginn dieser Arbeit weitgehend unbekannt. <br>Ziel dieser Arbeit war, Struktur und Funktion des F0–Teils von ATPasen weiter aufzuklären. Dafür wurde zunächst eine neue Isolierungsmethode für den Membranteil CF0 aus Spinatchloroplasten entwickelt, sie lieferte das intakte CF0 mit allen 4 Untereinheiten (UE) I, II, III und IV: Zuerst wurde CF0F1 aus Thylakoidmembranen extrahiert, dann der F1-Teil mit NaSCN denaturiert, schließlich der empfindliche F0-Teil in Anwesenheit eines optimierten Detergens/Lipidgemischs gereinigt, und zwar mit einer Sucrosegradienten-Zentrifugation, gefolgt von einer präparativen Elektroforese. Dabei wurde gleichzeitig auch der Komplex III14 isoliert. Beide Komplexe wurden zweidimensional kristallisiert. Aus III14 wurden 2D-Kristalle in 2 verschiedenen Kristallstrukturen erhalten, aus CF0 nur „Fladen“, große membranähnliche Verbände ohne Fernordnung. Beide wurden nach Negativkontrastierung im Transmissions-Elektronenmikroskop (TEM) und in wässriger Umgebung mit dem Rasterkraftmikroskop (AFM) im contact mode abgebildet. Nur die AFM-Bilder des III14 zeigten genug Kontrast für eine direkte Auswertung, alle anderen wurden einer Bildverarbeitung unterzogen. Nach automatischer Selektion von Bildern einzelner Komplexe, iterativem Ausrichten, Klassifizierung und Multireferenzausrichtung wurden Summenbilder erhalten, die strukturelle Details zeigten. Für III14 wurde im TEM eine Struktur aus 2 konzentrischen Ringen gefunden. Mit dem AFM konnten die alternierend angeordneten Ober- und Unterseiten der Komplexe unterschieden werden. Eine Seite zeigte einen Ring aus 14 abzählbaren Segmenten, jedes einer Kopie der UE III entsprechend; die andere einen etwas kleineren Ring, in dessen Mitte sich eine weitere ringförmige Struktur befand. Mit Hilfe von Rotationspowerspektren wurde auch hier eine 14-zählige Symmetrie gefunden. Damit konnte die Stöchiometrie zu 14 Kopien von UE III pro Komplex bestimmt werden. Der mittlere Durchmesser des Komplexes betrug 6.4 nm. Es wurde ein Modell beschrieben, bei dem die innere Struktur der kleinen Seite den N-Termini der UE III zugeordnet ist. Für CF0 wurden im TEM ähnliche Strukturen gefunden wie für III14, jedoch mit einer zusätzlichen, asymmetrisch angeordneten Proteinmasse, die sich von zwischen den Ringen bis jenseits des äußeren Rings erstreckte. Mit dem AFM wurde ohne Klassifizierung ebenfalls eine doppelte Ringstruktur gefunden, mit einer ähnlichen, sehr prominenten, asymmetrischen Masse, die den UE I, II und/oder IV zuzuordnen ist. Ein Strukturmodell wurde postuliert, bei dem UE IV teilweise innerhalb und außerhalb des Ringes III14 sitzt und fest an den Stator aus UE I und II bindet. Die asymmetrische Masse ist dann der UE IV und insbesondere dem verbrückenden Teil zwischen beiden Domänen zuzuordnen. <br>Untersuchungen zur Funktion des Membranteils EF0 aus E.coli hatten zum Ziel, das Zusammenwirken dreier konservierter Aminosäuren zu untersuchen. Es wird vermutet, dass Protonen durch die Membran entlang einiger für die Funktion essentieller Reste weitergereicht werden. In E.coli sind das u.a. R210 und E219 in UE a und D61 in UE c. Es war gefunden worden, dass die Mutationen E219G und R210A in UE a passive Protonenleitfähigkeit in EF0F1 und/oder EF0 bewirkten. Dies Verhalten war ungewöhnlich, da nicht konservative Mutationen an essentiellen Resten normalerweise die Protonenleitung völlig unterbinden. Um zu überprüfen, ob eine entkoppelte Restleitfähigkeit entlang der mutierten Aminosäuren vorlag, oder ob durch die Mutation eventuell die Assemblierung des Komplexes fehlerhaft erfolgte, wurden beide Mutationen durch Punktmutagenese mit einer neu entwickelten Klonierungsstrategie jeweils mit D61N in UE c zu einer Doppelmutante kombiniert. Die mutierten Enzyme wurden in ATPase-defizienten E.coli-Hintergrundstämmen exprimiert. Es stellte sich heraus, dass auch die Mutation E219G alleine keine Protonenpermeabilität erzeugte, die Daten in der Literatur also fehlerhaft waren. Für EF0F1 und EF0 mit der Mutation R210A wurde in Fluoreszenzlöschungs-Experimenten an den Plasmamembranen passive Protonenleitfähigkeit gefunden. Diese wurde durch die Kombination mit D61N unterbunden. Daraus wird gefolgert, dass D61 in UE c und R210 in UE a direkte Bestandteile des Protonenleitungspfades sind.","F-type H+-ATPases are essential enzymes of the energy metabolism. They occur in all types of cells, e.g. in bacterial plasma membranes (EF0F1), in chloroplast thylakoids (CF0F1) or in the inner mitochondrial membrane (MF0F1). They consist of the hydrophilic part F1 and the membrane integrated part F0, and they all share the same function: a transmembrane electrochemical potential difference of the protons provides the driving force for a proton transport across the membrane part F0, and the released energy is used in the F1-part for synthesis of ATP from ADP and phosphate. While the structure of the F1-part has been solved by X-ray analysis, the structure of the F0-part was widely unknown when this work was started. <br>The aim of this work was to further elucidate the structure and function of the F0–part of ATPases. First, a new isolation method for the membrane part CF0 from spinach chloroplasts was developed, it yielded the intact CF0 containing all four subunits (SU) I, II, III and IV: CF0F1 was first extracted from thylakoid membranes, then the F1-part was denatured with NaSCN. Finally, the sensitive F0–part was purified, in the presence of an optimized detergent/lipid mixture, via a sucrose gradient centrifugation, followed by a preparative electrophoresis. With this method, the complex III14 could be isolated simultaneously. Both complexes were crystallised two-dimensionally. III14 yielded 2D-crystals in two different crystal structures, while CF0 only yielded arrays, big membrane-like structures without a long-range order. Both were imaged by transmission electron microscopy (TEM) after negative staining and by atomic force microscopy (AFM) in contact mode in aqueous environment. Only the AFM images of III14 showed enough contrast for direct analysis, all others were electronically processed. After automatic selection of single complex images, iterative alignment, classification and multi reference alignment, sum images were generated that showed structural details. For III14 with TEM, a structure of two concentric rings was found. With AFM, the alternatingly arranged upper and lower sides of the complexes could be discerned. One side showed a ring of 14 countable segments, each corresponding to one copy of SU III, the other side showed a slightly smaller ring, inside which a further ring-like structure was found. By calculating rotational power spectra, a 14-fold symmetry could be found here, too. So the stoichiometry could be determined to 14 copies of SU III per complex. The average diameter of the complexes was 6.4 nm. A model was described in which the inner structure of the small side is assigned to the N-termini of SU III. For CF0 with TEM, similar structures were found as for III14, but with an additional protein mass arranged asymmetrically, starting in between the rings crossing the outer ring and extending beyond it. With AFM without classification, a double ring structure was found, too, together with a very prominent, asymmetric mass similar to the one seen in TEM. This protein mass has to be assigned to SU I, II and/or IV. A structure model was proposed, in which SU IV sits partly inside and partly outside of the ring III14 and binds tightly to the stator composed of SU I and II. The asymmetric mass is then assigned to SU IV, in particular to the bridging part between the two domains. <br>Our functional investigations of the membrane part EF0 from E.coli targeted the interaction of three conserved amino acids. It is assumed that protons are being passed on across the membrane along several amino acids that are essential for function. In E.coli, these are R210 and E219 in SU a and D61 in SU c, amongst others. The mutations E219G and R210A in SU a had been found to confer a passive proton conductivity on EF0F1 and/or EF0. This was unusual, as non-conservative mutations in essential amino acids normally abolish proton conductivity completely. 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