Die transkriptionelle Regulation des roughest Gens in Drosophila melanogaster

Roughest (Rst) ist ein Zelladhäsionsmolekül der Immunoglobulin-Superfamilie, das vielfältige Funktionen während der Entwicklung von Drosophila melanogaster einnimmt. Rst spielt unter anderem eine wichtige Rolle bei der axonalen Wegfindung in den optischen Loben, bei Zellsortierungen vor apoptotischen Prozessen im sich entwickelnden Komplexauge und bei Fusionen von Myoblasten zur embryonalen Muskulatur. In Übereinstimmung mit seiner pleiotrophen Wirkung zeigt Rst ein dynamisches Expressionsmuster in den betreffenden Geweben während der Entwicklung von Drosophila. Zudem findet sich Rst in Geweben wie der embryonalen Mittellinie, in denen die Funktionen von Rst bisher unbekannt sind. <br>Um einen Zugang für weitere Funktionen von Rst zu bekommen und um rst in das genregulatorische Netzwerk von Drosophila einzuordnen, wird in der vorliegenden Arbeit die transkriptionelle Regulation von rst untersucht. Durch die Identifizierung der Transkriptionsstartstelle von rst kann gezeigt werden, dass das rst Gen einen Promotor mit einem Initiator-Element und Downstream-Promoter-Elementen, aber ohne TATA-Box besitzt. In einem sogenannten Enhancer-Detection-Screen wurden cis-regulatorische rst Sequenzen identifiziert und durch die Konstruktion von rst-Gal4 Linien charakterisiert. Hierdurch kann gezeigt werden, dass das rst Gen durch eine komplexe Anordnung von Enhancer-Modulen reguliert wird. Unter anderem sind spezifische rst cis-regulatorische Sequenzen identifizierbar, die eine Expression in der embryonalen Mittellinie, in der embryonalen Muskulatur und in Interommatidialzellen des sich entwickelnden Komplexauges vermitteln. <br>Die in der vorliegenden Arbeit konstruierten rst-Gal4 Linien stellen hochspezifische experimentelle Werkzeuge dar und wurden in der vorliegenden Arbeit für eine gezielte Überexpression von Rst und seiner Interaktionspartner Hibris und Sticks-and-stones in Interommatidialzellen eingesetzt. <br>Um Regulatoren der rst Expression zu identifizieren, wurde mit Hilfe des Gal4/UAS-Systems in Drosophila ein Screen für Faktoren durchgeführt, die in der Lage sind, eine ektopische Aktivierung der rst Expression zu initiieren. Zudem wurden diese Faktoren darauf getestet, ob sie diese Aktivierung der rst Expression über die identifizierten rst cis-regulatorischen Sequenzen vermitteln. Hierdurch kann gezeigt werden, dass rst cis-regulatorische Sequenzen durch Single minded (Sim), Dmef2 und nukleare Effektoren der Ras-MAPK und Notch Signalwege aktiviert werden. Innerhalb dieser aktivierbaren rst cis-regulatorischen Sequenzen befinden sich Enhancer-Module, die eine mit der bekannten Wirkung der einzelnen Faktoren korrelierbare Reportergenexpression vermitteln. Sim, das Genprodukt des Selektorgens der embryonalen Mittellinie, wirkt auf eine rst cis-regulatorische Sequenz, die Enhancer für eine Expression in der embryonalen Mittellinie enthält. Dmef2 ist ein essentieller Faktor während der Entwicklung der embryonalen Muskulatur und wirkt auf rst cis-regulatorische Sequenzen, die in der embryonalen Muskulatur aktiviert werden. Eine Regulation der rst Expression durch Dmef2 liefert eine Erklärung für Muskelfusionsdefekte in Dmef2 Embryonen. Der Ras-MAPK und der Notch Signalweg spielen unter anderem bei apoptotischen Prozessen eine wichtige Rolle und wirken auf eine rst cis-regulatorische Sequenz, die kurz vor apoptotischen Prozessen in den Interommatidialzellen aktiviert wird. Diese Aktivierung von rst durch das Ras-MAPK Überlebenssignal und das proapoptotische Notch Signal bietet Hinweise für bisher unbekannte Funktionen von Rst bei apoptotischen Prozessen. Eine Sequenzanalyse der rst cis-regulatorischen DNA zeigt, dass sich innerhalb der betreffenden rst Enhancer-Module Konsensusbindungsstellen für Sim, Dmef2 und die nuklearen Effektoren der Ras-MAPK und Notch Signalwege befinden, die zwischen D. melanogaster und D. pseudoobscura konserviert sind. <br>In dieser Arbeit wird gezeigt, dass Rst in der embryonalen Mittellinie von sim Mutanten nicht exprimiert ist. Um zu testen, ob die beiden identifizierten Sim-Konsensusbindungsstellen des rst Mittellinien-Enhancers in vivo funktional sind, wurde eine zielgerichtete Mutagenese dieser Sequenzen im betreffenden rst Reportergenkonstrukt durchgeführt. Diese mutagenisierten rst cis- Sequenzen können keine Reportergenexpression in der frühen embryonalen Mittellinie vermitteln. Während der Entwicklung der optischen Loben wird rst hingegen nicht durch Sim reguliert.

Author dc:creator

• Apitz, Holger

Contributors dc:contributor

• Fischbach, Karl-Friedrich

• Drosophila
• Developmental biology
• Gene regulation

Repository record source_url

https://freidok.uni-freiburg.de/data/1216

OAI identifier oai:identifier

oai:freidok.uni-freiburg.de:1216