Charakterisierung der zellulären Bindung und Aufnahme von clostridialen Toxinen

C. difficile ist der Auslöser der Antibiotika-assoziierten Diarrhoe und der pseudomembranösen Colitis. Die beiden Hauptvirulenzfaktoren des Keims sind Toxin A und Toxin B. Beides sind Mitglieder der Familie der großen clostridialen Zytotoxine, zu denen noch das a-Toxin von C. novyi sowie das Letal-Toxin und das hämorrhagische Toxin von C. sordellii gehören. Die großen clostridialen Zytotoxine inaktivieren niedermolekulare GTPasen der Rho-Familie, die wichtige Signalproteine sind, durch Mono-O-Glucosylierung. Bisherige Untersuchungen haben zum Modell einer funktionellen Dreiteilung der Toxinmoleküle geführt: Die Toxine bestehen aus einer C-terminalen Bindungsdomänen, einer Translokationsdomäne und einer N-terminalen Enzymdomäne. <br>In der vorliegenden Arbeit wurde die Aufnahme von C. difficile Toxin B und insbesondere eine Prozessierung des Toxins untersucht. Eine weitere Aufgabe war die Entwicklung einer schnellen Nachweismethode der Toxine von C. difficile. <br>Im Rahmen dieser Arbeit wurden Fragmente von Toxin B und das komplette Holotoxin rekombinant exprimiert, um die Bindung und Translokation an eukaryote Zellen zu untersuchen. Es konnte gezeigt werden, dass ein 1820 Aminosäuren umfassender C-terminaler Bereich des Toxins, das Fragment CDB547-2366 für die zelluläre Bindung und Translokation verantwortlich ist. Dieses Fragment wurde in endosomalen Kompartimenten und nach Zelllyse in der Membranfraktion nachgewiesen. Das Fragment CDB547-2366 inserierte bei niedrigen pH-Werten in Zellmembranen sowie künstliche Lipidmembranen und bildete Ionen-permeable Poren. Nach der Intoxikation von Zellen mit dem Holotoxin konnte im Zytosol der Zielzellen CDB547-2366 nicht nachgewiesen werden. Dagegen wurde gezeigt, dass ein ~65 kDa großes Fragment in das Zytosol der Zielzelle übergeht. Dieses Fragment zeigte im in vitro-Glucosylierungsversuch volle katalytische Aktivität und konnte mittels immunochemischer und massenspektometrischer Methoden als N-terminales Fragment von Toxin B identifiziert werden. Aus den vorgelegten Ergebnissen ergibt sich folgendes Model der Aufnahme von C. difficile Toxin B in eukaryote Zellen: nach Bindung an einen spezifischen Rezeptor an der Zelloberfläche wird Toxin B über Rezeptor-vermittelte Endozytose in eukaryote Zellen aufgenommen. Nach Ansäuern der Endosomen kommt es wahrscheinlich zu einer Konformationsänderung des Toxins. Hydrophobe Bereiche werden exponiert und inserieren in die Endosomenmembran. Der enzymatisch aktive Teil geht in das Zytosol über und monoglucosyliert die kleinen GTPasen der Rho-Familie. <br>Im Rahmen dieser Arbeit konnte durch den Nachweis des enzymatisch aktiven Fragments im Zytosol von Zielzellen erstmals gezeigt werden, dass nur ein Teil von Toxin B in das Zytosol transloziert und die Bindungs-/Translokationsdomäne in <br>endosomalen Membranen verbleibt. Diese Untersuchungen lieferten grundlegende Informationen zur Verständnis der zellulären Aufnahme der großen clostridialen Zytotoxine. <br>Zur Untersuchung der Epidemologie und Pathogenität von C. difficile Stämmen wurde ein Nachweissystem für die Toxintypisierung entwickelt. Zur Erfassung der Varianten der Toxine von C. difficile wurde die Polymerase-Ketten-Reaktion eingesetzt. Die Gene von Toxin A und B sind chromosomal in einem toxigenen Element, dem Pathogenitätslokus lokalisiert. Es wurde eine Methode etabliert, die es ermöglicht, in einem Schritt die Toxinvarianten zu bestimmen. Im Gegensatz zu bisher üblichen Methoden, bei denen bis zu neun verschiedene PCR-Ansätze nötig waren, konnten der Aufwand und die Zeit zur Untersuchung von C. difficile Stämmen erheblich reduziert werden. Mittels einer weiteren PCR-Methode konnte auch das Gen der ADP-Ribosyltransferase CDT in C. difficile Stämmen nachgewiesen werden. Diese Methoden ermöglichen eine schnelle Charakterisierung von C. difficile Stämmen. <br>Untersuchungen von klinischen Isolaten von C. difficile zeigten, dass wahrscheinlich die Detektion aller bekannten Pathogenitätsfaktoren (Toxin A, Toxin B und CDT) für die diagnostische Erfassung des Keim notwendig ist.

Author dc:creator

• Pfeifer, Gunther

Contributors dc:contributor

• Bechthold, Andreas

• Clostridien
• bakterielle toxine
• zelluläre Aufnahme
• bacteria
• clostridia
• bacterial toxins
• cellular uptake

Repository record source_url

https://freidok.uni-freiburg.de/data/1211

OAI identifier oai:identifier

oai:freidok.uni-freiburg.de:1211