Untersuchungen zur Substratspezifität der ADP-Ribosyltransferasen Clostridium botulinum C2-Toxin und Clostridium perfringens Iota-Toxin

Clostridium perfringens Iota-Toxin und Clostridium botulinum C2-Toxin gehören zur Familie der binären Aktin-ADP-ribosylierenden Toxine. Die Toxine bestehen aus einer Enzymkomponente (ADP-Ribosyltransferase) und einer separaten Bindungs- und Translokationskomponente, die die Zellaufnahme vermittelt. Die enzymatisch aktiven Toxinbestandteile Iota a (Ia) und C2I übertragen den ADP-Riboserest von NAD auf Arginin-177 von Aktin, wodurch die Polymerisierbarkeit von Aktin gehemmt wird. Die Toxine unterscheiden sich in ihrer Substratspezifität: Während C2I nur beta/gamma-Aktin ADP-ribosyliert, modifiziert Iota a auch alpha-Aktin-Isoformen. <br>In der vorliegenden Arbeit wurde eine Struktur-Funktionsanalyse der Enzymkomponente der Toxine durchgeführt. Insbesondere sollte untersucht werden, welche Bereiche der Enzyme für die unterschiedliche Substratspezifität verantwortlich sind. Dazu wurden N- und C-terminal verkürzte Varianten von Iota a und C2I kloniert, in E. coli als GST-Fusionsproteine exprimiert und hinsichtlich ihrer ADP-Ribosyltransferase-Aktivität und Substratspezifität in vitro geprüft. Zum selben Zweck wurden auch chimärische Proteine hergestellt, die aus verschiedenen Anteilen beider ADP-Ribosyltransferasen bestanden. <br>Die Konstrukte GST-Ia(101-413), GST-Ia(177-413) und GST-Ia(208-413) verhielten sich bezüglich ihrer Substratspezifität wie Wildtyp-Ia. Dies zeigte, daß der N-terminale Anteil von Ia für die enzymatische Aktivität und die Substratspezifität entbehrlich ist. Hingegen waren N-terminale Verkürzungen des C2I, ebenso wie eine C-terminale Verkürzung dieser ADP-Ribosyltransferase, enzymatisch inaktiv. <br>Es gelang, mit der chimären ADP-Ribosyltransferase GST-C2I(1-227)/Ia(205-413) ein Konstrukt herzustellen, das sich hinsichtlich der Substratspezifität wie Wildtyp-Ia verhielt. Weitere Chimären führten zur Charakterisierung der strukturellen Voraussetzungen der ADP-Ribosyltransferase-Aktivität der Toxine. Dabei zeigte sich, daß die Enyzmkomponente von Iota-Toxin weitaus „robuster“ gegen strukturelle Veränderungen war als die von C2-Toxin. Die Schwierigkeit, daß Enzymbereiche, die vermutlich die Substratspezifität der Toxine determinieren, gleichzeitig für die NAD-Bindung und Katalyse verantwortlich sind, führte zu zahlreichen inaktiven Chimären. Es konnten jedoch verschiedene enzymatisch aktive, chimärische Proteine konstruiert werden, die eine Modifikation in diesem Bereich aufwiesen [GST-Ia(1-394)/C2I(404-431), GST-C2I(1-363)/Ia(355-365)/C2I(375-431) und GST-Ia(1-321)/C2I(332-350)/Ia(341-413)]. Die ausgetauschten Aminosäurereste hatten allerdings keinen Einfluß auf die Substratspezifität der jeweiligen ADP-Ribosyltransferasen. <br>Die Ergebnisse zeigen, daß die Substratspezifität – zusammen mit der enzymatischen Aktivität – in der C-terminalen Domäne der hier untersuchten ADP-Ribosyltransferasen determiniert ist. Es konnten weiterhin Bereiche der Primärsequenz innerhalb dieser Domänen bestimmt werden, deren Austausch keinen Einfluß auf die Substratspezifität hat. <br>Der hier durchgeführte Austausch von Anteilen der Primärsequenzen führte allerdings in einigen Fällen zu enzymatisch inaktiven Konstrukten. Dies ist höchstwahrscheinlich auf eine gestörte Struktur der NAD-Bindungsstelle und/oder eine fehlerhafte Proteinfaltung zurückzuführen.

Author dc:creator

• Liese, Jan

Contributors dc:contributor

• Aktories, Klaus

• bakterielle Toxine
• bacterial toxins
• nad-adp-ribosyltransferase
• clostridium botulinum
• clostridium perfringens

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