Untersuchungen zur Substratspezifität der ADP-Ribosyltransferasen Clostridium botulinum C2-Toxin und Clostridium perfringens Iota-Toxin
Clostridium perfringens Iota-Toxin und Clostridium botulinum C2-Toxin gehören zur Familie der binären Aktin-ADP-ribosylierenden Toxine. Die Toxine bestehen aus einer Enzymkomponente (ADP-Ribosyltransferase) und einer separaten Bindungs- und Translokationskomponente, die die Zellaufnahme vermittelt. Die enzymatisch aktiven Toxinbestandteile Iota a (Ia) und C2I übertragen den ADP-Riboserest von NAD auf Arginin-177 von Aktin, wodurch die Polymerisierbarkeit von Aktin gehemmt wird. Die Toxine unterscheiden sich in ihrer Substratspezifität: Während C2I nur beta/gamma-Aktin ADP-ribosyliert, modifiziert Iota a auch alpha-Aktin-Isoformen. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Struktur-Funktionsanalyse der Enzymkomponente der Toxine durchgeführt. Insbesondere sollte untersucht werden, welche Bereiche der Enzyme für die unterschiedliche Substratspezifität verantwortlich sind. Dazu wurden N- und C-terminal verkürzte Varianten von Iota a und C2I kloniert, in E. coli als GST-Fusionsproteine exprimiert und hinsichtlich ihrer ADP-Ribosyltransferase-Aktivität und Substratspezifität in vitro geprüft. Zum selben Zweck wurden auch chimärische Proteine hergestellt, die aus verschiedenen Anteilen beider ADP-Ribosyltransferasen bestanden. Die Konstrukte GST-Ia(101-413), GST-Ia(177-413) und GST-Ia(208-413) verhielten sich bezüglich ihrer Substratspezifität wie Wildtyp-Ia. Dies zeigte, daß der N-terminale Anteil von Ia für die enzymatische Aktivität und die Substratspezifität entbehrlich ist. Hingegen waren N-terminale Verkürzungen des C2I, ebenso wie eine C-terminale Verkürzung dieser ADP-Ribosyltransferase, enzymatisch inaktiv. Es gelang, mit der chimären ADP-Ribosyltransferase GST-C2I(1-227)/Ia(205-413) ein Konstrukt herzustellen, das sich hinsichtlich der Substratspezifität wie Wildtyp-Ia verhielt. Weitere Chimären führten zur Charakterisierung der strukturellen Voraussetzungen der ADP-Ribosyltransferase-Aktivität der Toxine. Dabei zeigte sich, daß die Enyzmkomponente von Iota-Toxin weitaus „robuster“ gegen strukturelle Veränderungen war als die von C2-Toxin. Die Schwierigkeit, daß Enzymbereiche, die vermutlich die Substratspezifität der Toxine determinieren, gleichzeitig für die NAD-Bindung und Katalyse verantwortlich sind, führte zu zahlreichen inaktiven Chimären. Es konnten jedoch verschiedene enzymatisch aktive, chimärische Proteine konstruiert werden, die eine Modifikation in diesem Bereich aufwiesen [GST-Ia(1-394)/C2I(404-431), GST-C2I(1-363)/Ia(355-365)/C2I(375-431) und GST-Ia(1-321)/C2I(332-350)/Ia(341-413)]. Die ausgetauschten Aminosäurereste hatten allerdings keinen Einfluß auf die Substratspezifität der jeweiligen ADP-Ribosyltransferasen. Die Ergebnisse zeigen, daß die Substratspezifität – zusammen mit der enzymatischen Aktivität – in der C-terminalen Domäne der hier untersuchten ADP-Ribosyltransferasen determiniert ist. Es konnten weiterhin Bereiche der Primärsequenz innerhalb dieser Domänen bestimmt werden, deren Austausch keinen Einfluß auf die Substratspezifität hat. Der hier durchgeführte Austausch von Anteilen der Primärsequenzen führte allerdings in einigen Fällen zu enzymatisch inaktiven Konstrukten. Dies ist höchstwahrscheinlich auf eine gestörte Struktur der NAD-Bindungsstelle und/oder eine fehlerhafte Proteinfaltung zurückzuführen.
bakterielle Toxine, bacterial toxins, nad-adp-ribosyltransferase, clostridium botulinum, clostridium perfringens
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