Caracterización de la función de la proteína humana znf330/noa36 mediante estudios interactómicos y de mutagénesis con el sistema crispr/cas9

Inicialmente descrita como un autoantígeno, NOA36/ZNF330 (NOA36 de aquí en adelante) es una proteína nucleolar con dominios en dedos de zinc cuya secuencia de aminoácidos está muy conservada en grupos taxonómicos eucariotas unicelulares y pluricelulares, tanto del reino animal como vegetal, lo que indica que debe tener un papel fisiológico muy relevante. El gen de NOA36 se expresa en todos los tejidos y líneas celulares humana y, aunque anteriormente se relacionó la función de esta proteína con la apoptosis en células humanas y la morfogénesis muscular y la hematopoyesis en Drosophila, hay pocos estudios que indaguen su papel fisiológico o su interacción con otras proteínas. En esta tesis se investiga la interacción de NOA36 con otras proteínas mediante un estudio interactómico en el que se combina la inmunoprecipitación con el análisis proteómico mediante espectrometría de masas (AP-EM), utilizando extractos de proteínas de células HeLa que sobreexpresan la proteína recombinante Flag-NOA36. Como resultado de este estudio se encontró que NOA36 interacciona con las proteínas de choque térmico HSPA1 y HSPA8, lo que posteriormente se validó mediante co-inmunoprecipitación de las proteínas recombinantes en células HeLa y HEK293. En este análisis se detectó también una posible interacción con la proteína Enhancer of Rudimentary Homolog (ERH) que en células humanas está involucrada en la regulación del ciclo celular. Dado que estos resultados indicaban que NOA36 podría estar relacionada con la respuesta al estrés y el ciclo celular, se realizaron ensayos de tratamiento de choque térmico en células HEK293 en las que se examinó la apoptosis, el ciclo celular y la proliferación mediante citometría de flujo. Para analizar la falta de función del gen NOA36 se empleó una línea celular derivada de HEK293 en la que se eliminó su expresión mediante la tecnología CRISPR/CAS9n (línea celular 2D12). Los resultados obtenidos indican que la falta de expresión de NOA36 no afecta a la apoptosis inducida por el choque térmico, pero sí al ciclo celular y la proliferación. Así, la población de células en fase S en 2D12 disminuyó drásticamente 24 horas después del choque térmico, mientras que en la línea parental HEK293 se produjo una disminución significativamente menor y además se observó a una disminución en G1 y un aumento de la población en fase G2. Asimismo, la sobreexpresión de Flag-NOA36 en células 2D12 restableció la proliferación. Para investigar si la falta de función de NOA36 afectaba a la producción de las proteínas de choque térmico, se realizó un análisis mediante RT-qPCR de la expresión los genes HSPA1, HSPA8 y HSP90AB en las líneas celulares HEK293 y 2D12, tanto en células tratadas con choque térmico como en células sin tratar. Este análisis reveló que no había diferencias drásticas entre ambas líneas celulares, lo que indica que el efecto observado en el ciclo celular no se debe a una diferente expresión de los genes HSP. Por último, se investigó el dominio responsable de la muerte celular descrito previamente con la sobre-expresión de NOA36-eGFP en células HeLa (aminoácidos 92-139 fusionados a eGFP) utilizando un péptido sintético y como vehículo de entrada en las células, una secuencia CPP (cell penetrating peptide) que se testó en varias líneas celulares. Aunque el análisis mediante citometría de flujo mostró que tratamientos con 5 uM del péptido en la línea celular de cáncer de ovario IGROV provocaba apoptosis, este efecto no fue específico de secuencia, ya que el tratamiento con un péptido scramble provocó un aumento similar de apoptosis. Estos resultados indicarían que estas células son sensibles al tratamiento, como parece indicar el aumento de vacuolas citoplasmáticas, posiblemente autofágicas.

Author dc:creator

• Sánchez-Briñas Otte, Alejandra

Advisor dc:contributor.advisor

• Bolívar Pérez, Jorge

Statement dc:rights

• Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 Internacional

Licence dc:rights.uri

• http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/

Language dc:language.iso

spa

Handle dc:identifier.uri

http://hdl.handle.net/10498/33397

OAI identifier oai:identifier

oai:rodin.uca.es:10498/33397